Revista Científica UDO Agrícola Volumen 9.
Número 3. Año 2009. Páginas: 475-486
Ingeniería
genética aplicada al café
Genetic engineering applied to coffee
Zoraya DE GUGLIELMO CRÓQUER
Laboratorio de Genética, Instituto de Oncología y
Hematología, Universidad Central de Venezuela. Ciudad Universitaria, Los
Chaguaramos, Caracas, Venezuela. E-mail: zdegugli@gmail.com
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Recibido: 17/03/2009 |
Fin de
primer arbitraje: 03/08/2009 |
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Primera
revisión recibida:
09/08/2009 |
Aceptado: 01/10/2009 |
RESUMEN
Café es el nombre común de las semillas provenientes de los arbustos
del género Coffea,
de la familia de las Rubiáceas, cuyo cultivo tiene
gran importancia agronómica y comercial en el mundo. Esta planta está expuesta a
distintos tipos de estrés biótico y abiótico que pueden afectar su rendimiento
y productividad, ocasionando pérdidas económicas considerables. Debido a esto,
se han realizado diversas investigaciones enfocadas en su mejoramiento tanto
por métodos tradicionales como por ingeniería genética. En este trabajo se
realizó una revisión sobre aspectos básicos de la aplicación de técnicas de
biología molecular y cultivo de tejidos para el desarrollo de resistencia a
factores biológicos y físicos que afectan al café.
Palabras clave: Café, ingeniería genética, transformación genética, cultivo in vitro
ABSTRACT
Coffee is the common name of seeds from bushes of the genus Coffea, family Rubiaceae, whose cultivation is of great agricultural and
commercial importance on the world. This plant is exposed to various biotic and
abiotic stress that can affect its performance and
productivity, causing considerable economic losses. Because of this, there have
been several investigations focused on its improving both by traditional
methods such as genetic engineering. In this paper, a review was conducted on
basic aspects of the application of molecular biology techniques and tissue
culture for the development of resistance to biological and physical factors
affecting the coffee.
Key words: Coffee, genetic engineering,
genetic transformation, in vitro
culture
INTRODUCCIÓN
Desde que el hombre
comenzó a sembrar semillas silvestres y a escoger las plantas y frutos por su
color, sabor, textura y conservación se produjo un proceso de selección que
condujo a la modificación de las frecuencias alélicas en un cultivo.
Posteriormente, se introdujo el mejoramiento formal con las hibridaciones entre
individuos seleccionados, lo que permitió la transferencia de caracteres de
interés entre especies e, incluso, de especies silvestres a las de interés
agronómico. En los últimos años, con el
auge de las técnicas moleculares y los sistemas de cultivo in vitro ha surgido
Mejoramiento
genético del café y cultivo in vitro
Dadas
las características del café en cuanto a crecimiento (planta semi-perenne de crecimiento lento que produce la primera
cosecha a partir de los 3 años de edad), el mejoramiento mediante métodos
tradicionales basados en la selección, cruces con individuos seleccionados y
propagación de dichos individuos, puede implicar largos periodos de tiempo; por
ello, la combinación de métodos de mejoramiento tradicional y métodos de
transformación genética (Agrobacterium,
biobalística o electroporación)
ofrece una alternativa para lograr el mejoramiento de esta planta (Etienne et al.
2002; Café Imperial-Venezuela, 2005).
Las técnicas de cultivo de tejidos están
bien establecidas en algunas especies de cafeto, resaltando Coffea arabica y Coffea canephora,
a partir de muestras obtenidas de la mayoría de los órganos. La propagación
puede ser mediante microesquejes (por organogénesis)
o por embriogénesis somática, siendo esta última la principal vía de
regeneración por presentar la mayor tasa de multiplicación (Baumann
y Neuenschwander 1990). Söndhal
y Mónaco (1981) y Menéndez-Yuffá et al. (1994) señalan que este método fue establecido inicialmente
por Staritsky
en
La inducción de embriogénesis somática
requiere la combinación de una auxina y una citoquinina
(la segunda en mayor proporción respecto a la primera), aunque es posible tal
inducción con el uso de una citoquinina solamente
(García y Menéndez-Yuffá 1987; Hatanaka
et al. 1991). Gatica et al. (2008a) evaluaron el
efecto del triacontanol (TRIA), un alcohol vegetal
primario endógeno que incrementa el crecimiento y la productividad al elevar la
producción de ATP y la fotosíntesis, observando que la combinación del TRIA con
ácido indolacético (AIA) aumenta la formación de
embriones somáticos en C. arabica cvs. Catuaí y Caturra. Otro factor importante en la producción
de embriones somáticos es la concentración de CO2; Barbón et al. (2008) estudiaron el efecto de este gas en la embriogénesis
somática de C. arabica
cv Caturra Rojo, reportando que la concentración más baja probada (2,5%) estimuló
la producción de embriones somáticos y su diferenciación en suspensiones
celulares embriogénicas. Explicaron que este efecto se debe a que el CO2
modifica el pH del medio.
Los
embriones formados por embriogénesis somática pasan por los mismos estadios que
los embriones cigóticos: globular, corazón y torpedo,
y la diferenciación es asincrónica ya que suelen observarse las tres formas de
embriones simultáneamente sobre la superficie del callo. Los embriones del tipo
torpedo, a punto de entrar al estado cotiledonar,
pueden dar origen a embriones somáticos secundarios que se observan en la zona
basal del hipocotilo, lo que es indicativo del alto
potencial de regeneración de este cultivo (Menéndez-Yuffá
y García 1997). Por otra parte, en estudios sobre expresión de proteínas, se
han reportado diferencias en los patrones electroforéticos de callo
embriogénico y no embriogénico, así como entre embriones globulares, corazón y
torpedo; esto sería indicativo de una expresión diferencial de proteínas que
estaría correlacionada con diferencias histológicas a nivel de callo y con las
distintas fases de desarrollo de los embriones somáticos (Menéndez-Yuffá et al.
1994).
En
cuanto a la adaptación a tierra de las plantas obtenidas in vitro, se ha señalado que tal adaptación es exitosa y que el crecimiento es igual al de las
plantas obtenidas a partir de semilla (Peña 1983; Peña y Serna 1984). Sin
embargo, Barry-Etienne et al. (2002) indican que la
fase de aclimatación ex vitro puede
ser problemática y ocasionar pérdidas.
Es posible que esto se relacione al uso excesivo de reguladores de crecimiento,
lo que a su vez pudiera causar alteraciones en el material genético de las vitroplantas y afectar negativamente el proceso de
adaptación ex vitro. Al respecto,
Menéndez-Yuffá y García (1998) estudiando el material
genético de plantas obtenidas in vitro,
encontraron que en casi el 80% de las células analizadas la mitosis ocurría en
forma normal; pero hubo un bajo porcentaje con alteraciones en el número
cromosómico, lo cual es desfavorable para la conservación de las
características de las plantas y pudiera estar involucrado en las pérdidas
durante la adaptación ex vitro.
También
se ha establecido con éxito el cultivo en suspensión, en el cual se generan
embriones somáticos en gran escala y se producen metabolitos secundarios
(Zamarripa 1991; Menéndez-Yuffá y García 1998); las
suspensiones celulares ofrecen ventajas como sistema de propagación masiva de
plantas por las altas tasas de multiplicación que presentan, una mayor
homogeneidad en las condiciones de cultivo y la posibilidad de automatización
(Hermoso-Gallardo y Menéndez-Yuffá 2000). La
automatización llevó al desarrollo del Sistema de Inmersión Temporal o RITA,
concebido por el CIRAD, en el cual el contacto de los explantes
con el medio de cultivo líquido se reduce a pocos minutos por día, lo que
permite eliminar desórdenes fisiológicos ligados a la inmersión permanente
propia de los biorreactores clásicos y los frascos
Erlenmeyer, incluyendo el desarrollo asincrónico de la población de embriones,
anomalías morfológicas y heterogeneidad del tamaño; mediante este sistema, para
C. arabica, se ha señalado la obtención de 7500 a 15000
plantas aclimatadas por gramo de suspensión embriogénica puesto a regenerar
después de 9 meses de cultivo, de los cuales 6 transcurrieron in vitro (Etienne
et al. 1999).
Cabe destacar que el cultivo in vitro es muy importante para la
preservación del germoplasma, considerando que las semillas de café pierden
viabilidad con el tiempo. El desarrollo e implementación de esta técnica
permite mantener el germoplasma en espacios reducidos, facilita su transporte y
reduce los riesgos fitosanitarios (Menéndez Yuffá y
García 1998). Además, el cultivo de tejidos in
vitro es pilar fundamental para la regeneración y, en consecuencia, el
éxito del mejoramiento vegetal mediante transformación genética. En el caso
particular de la embriogénesis somática secundaria, la formación de embriones
somáticos secundarios a partir de tejidos potencialmente transformados (callo
embriogénico, embriones torpedos y hojas de vitroplantas)
es interesante, no solo desde el punto de vista regenerativo, sino también por
la posibilidad de eliminar fenómenos de expresión genética en mosaico, lo cual,
según Bastar et al. (2004) se refiere
a que células individuales en tejidos vegetales transformados poseyendo la
misma constitución genética y aparentemente la misma información tejido
específica, expresen silenciamiento del gen en una parte del tejido. Tal posibilidad
tendría lugar considerando el origen unicelular de los embriones, la formación
de embriones secundarios a partir de células potencialmente transformadas y la
regeneración de plantas a partir de estos embriones secundarios (las cuales, en
consecuencia, expresarían al transgen uniformemente).
Esto
pone en evidencia la importancia de la embriogénesis somática secundaria en los
programas de mejoramiento vegetal a través de métodos de transformación
genética, puesto que las plantas transgénicas pueden ser propagadas masivamente
a partir de
tejidos potencialmente transformados, manteniendo su fidelidad genética
(Fernández et al. 2005).
Características
de la transformación genética del café
A pesar del éxito reportado en relación a
la introducción de genes foráneos (reporteros y/o de selección) en café por
distintos investigadores utilizando diferentes métodos de transformación, el
registro de regeneración del material transformado y la obtención de plantas
transgénicas es limitado. Es solo en los últimos años, después de diferentes
pruebas y modificaciones que se han realizado en las distintas metodologías,
cuando se ha logrado la regeneración del material sometido a transformación
genética.
Los estudios sobre transformación
genética de café se han llevado a cabo mediante métodos biológicos (Agrobacterium) y métodos físicos (polietilenglicol,
electroporación y biobalística)
con la finalidad de estandarizar los parámetros de transformación y de
introducir genes para la resistencia a antibióticos, herbicidas y plagas.
Genes
foráneos introducidos en café
Los genes introducidos en café para la
evaluación de métodos de transformación genética, son básicamente de origen bacteriano (gus, nptII, hpt, bar, rol, aux, nos, cry1ac),
aunque también se han empleado genes de origen vegetal (csr 1).
El gen gus o uida
obtenido de Escherichia coli es utilizado como gen reportero, ya que
permite monitorear a corto plazo el resultado del procedimiento de
transformación genética, a partir de la producción de color en los explantes transformados consecuencia de la acción de la
enzima b-glucuronidasa
(codificada por dicho gen) sobre su sustrato, el X-gluc
(5-bromo-4-cloro-3-indolyl-glucurónido). La prueba de expresión transitoria de
este gen reportero se ha realizado mediante la reacción histoquímica GUS, según
el protocolo descrito por Jefferson et al. (1987). Esta reacción ha sido
empleada
en estudios de estandarización a partir de la expresión transgénica
transitoria. Tales pruebas de estandarización
son la base para la puesta a punto de un protocolo de transformación eficiente
donde se ha maximizado la cantidad de células competentes en las que ocurren,
de manera simultánea en una misma célula, tres procesos necesarios para obtener
una planta transgénica: transferencia del transgen al
interior de la célula, integración del transgen al
ADN celular y regeneración de una planta completa en la que se verificaron los
pasos anteriores (Díaz et al. 2004).
Esto es muy importante considerando que células y explantes
de distinto genotipo, e incluso explantes diferentes
de un mismo genotipo, tienen diferente competencia o capacidad de respuesta
para cada uno de los procesos mencionados. Al respecto, Gahakwa et al. (2000)
señalan que con diversas especies vegetales, especialmente de interés
agronómico, se han realizado pruebas de transformación con genes marcadores y
reporteros, lo cual constituye en la mayoría de los casos el primer paso para
la transformación con genes de interés; estas pruebas proveen información útil
sobre la herencia y expresión de los genes utilizados en plantas transgénicas,
pero es importante confirmar si los resultados obtenidos usando genes
marcadores o reporteros pueden ser extrapolados a genes agronómicamente
importantes. Estos autores, trabajando con arroz y utilizando genes marcadores
(bar), reporteros (gus) y con
actividad insecticida (cry1ac,
cry2a) encontraron que tales
resultados eran extrapolables. Igualmente, Chen et
al. (1998) reportaron una correlación positiva entre expresión transitoria
e integración estable con el uso del bombardeo de micropartículas.
Por su parte, Tian y Seguin
(2004) explican que la relación entre expresión transitoria e integración
estable de genes introducidos no es simple y que si bien la expresión
transitoria no es el único factor determinante para la transformación estable,
constituye el de mayor peso, por lo que los resultados de pruebas de expresión
transitoria son frecuentemente utilizados como indicadores para el desarrollo
de transformación estable en muchas plantas y tejidos.
Los genes nptII
y hpt se han usado como marcadores de
selección en base a la resistencia a antibióticos. El primero proviene de E.
coli y codifica a la enzima neomicina
fosfotransferasa, la cual confiere resistencia a la kanamicina y la paramomicina. Este gen fue
colocado bajo el control de un promotor no funcional en bacterias, a pesar de
lo cual es un sistema de selección altamente eficiente; esto le confiere
ventajas a nivel de bioseguridad en comparación a otros genes de resistencia
bajo el control de promotores funcionales en bacterias, ya que se elimina el
riesgo de expresión o de flujo genético horizontal de genes de resistencia a
antibióticos desde la planta transgénica a las bacterias entéricas o del suelo.
Libiakova et al.
(2001) insertaron el intrón IV2 de un gen de papa en
el centro de la secuencia codificante nptII para prevenir la expresión de este gen procariota en bacterias entéricas y animales domésticos
como consecuencia del flujo genético desde
las plantas transformadas. Dicho intrón contiene
numerosos codones de terminación que, entonces, interrumpen el marco de lectura
abierto de nptII. También se ha señalado que este gen no
es alergeno (Courvalin
1998). Por su parte, el gen hpt codifica a la enzima higromicina
fosfotransferasa y confiere resistencia a la higromicina; proviene de la bacteria Streptomyces hygroscopicus.
Los genes bar, pat y csr1-1 confieren resistencia a
herbicidas. Los primeros provienen de S. hygroscopicus y S.
viridochromogenes, respectivamente, y codifican a
la enzima fosfinotricina acetiltransferasa
para la resistencia al glufosinato de amonio, herbicida conocido como Basta o Bialaphos; el tercero, también llamado ahas, ha sido aislado de Arabidopsis thaliana y
confiere resitencia al herbicida clorosulfurón a partir de la enzima acetolactatosintetasa.
El gen nos proviene
de A. tumefaciens
y los genes rol y aux provienen de A. rhizogenes ; se han usado como
marcadores de selección de transformantes a partir de la morfogénesis.
Para la resistencia a lepidópteros,
como el minador de la hoja del café Leucoptera coffeella, se ha utilizado el gen cry1ac aislado de Bacillus thuringiensis. En el caso particular de esta plaga,
considerada como la de mayor infestación del café arábigo (Mondragón et al. 2004) es de gran interés la
transformación genética para su control, ya que el daño es producido en la fase
de larva, la cual tiene un desarrollo endocárpico
estricto, por lo que el rocío de formulaciones químicas pierde practicidad.
Además, se ha señalado que la proteína codificada por el gen cry1ac es un biopesticida
específicamente tóxico para larvas de lepidópteros, inocua para el ambiente y
otros seres vivos, a diferencia del control químico que tiene un amplio rango de
acción y efectos contaminantes considerables (Guerreiro
et al. 1998). La secuencia
codificante nativa del gen cry1ac ha
sido modificada mediante técnicas de Ingeniería Genética para favorecer su
expresión en plantas; esta modificación consistió en el aumento del contenido
de pares de base G+C, de 37% a 47,7%, con lo que se incrementó la homología entre el gen y el
genoma vegetal, sin alterar las características del producto final del gen
(Sardana et al. 1996).
En relación al control de la
maduración del grano de café, proceso fundamental a nivel de la calidad y el
valor del producto, se han clonado dos genes que codifican enzimas involucradas
en la síntesis de etileno, la amino 1-ciclopropano carboxílico sintetasa o ACC sintetasa y la
amino 1-ciclopropano carboxílico oxidasa o ACC oxidasa, los cuales se perfilan
como elementos claves para el establecimiento de sistemas de transformación
genética de café con el objetivo de controlar el proceso de maduración del
grano (Pereira et al. 2005). Respecto a la tolerancia
a estrés abiótico (condiciones de sequía, salinidad, fitotoxicidad
por metales y frío,) se han producido plantas transformadas con factores de
transcripción que inducidos por cualquiera de estas condiciones activan una
familia de genes que incrementan la tolerancia del café; esta familia incluye
los genes cor15a, cor6.6, rd29A, kin1 y
rd17 (Kasuga et
al. 1999).
Promotores y terminadores
Los genes introducidos al café en los estudios de transformación
genética han sido colocados bajo el control de promotores constitutivos, como
el CaMV35S y EF1α. Es importante considerar que a pesar de que los
promotores constitutivos actúan en todos los tejidos, cada vez que se insertan
genes regulados por este tipo de promotores se observan diferencias en cuanto a
la especificidad para el tejido o el grado de expresión de los genes bajo su
control. En consecuencia, aún cuando se activan los
genes, no siempre se activan en el mismo grado en todos los tejidos (Rodríguez
y Chamberlin 1982). El EF1α ha sido obtenido de A. thaliana. El más utilizado ha sido el
promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S), considerado como
un promotor fuerte (también puede
regular la expresión genética en organismos no relacionados). El CaMV es el principal miembro de los caulimovirus,
que además son los únicos virus vegetales conocidos que poseen ADN de doble
cadena. Ha mostrado ser menos eficiente en la transformación de
monocotiledóneas del tipo cereales, en las cuales han resultado más efectivos
los promotores Act I de arroz y Ubi
I de maíz. El efecto contrario se ha reportado para monocotiledóneas no
cereales, donde la efectividad del promotor CaMV35S incrementa
considerablemente cuando se le emplea duplicado (Kanno
et al. 2000). En este sentido, la
duplicación de dicho promotor parece tener un efecto intensificador sobre su
función a nivel de expresión. A pesar de que el promotor CaMV35S es, al
parecer, más fuerte que otros promotores constitutivos, los promotores Act I y Ubi I tienen la ventaja,
desde el punto de vista de la bioseguridad, de ser de origen vegetal; algunos
investigadores también han reportado que, si bien el número de transformantes
iniciales obtenidos con el promotor CaMV35S es más elevado que con el Ubi I o el Act I, con el primero
pudiera ser igualmente mayor el eventual silenciamiento observado (Dahleen et al.
2001).
Leroy et al. (2000) trabajando en transformación de café utilizaron el
promotor CaMV35S duplicado, con lo cual reportaron un efecto intensificador en
la regulación de la expresión del gen csr1-1
aislado de A. thaliana,
el cual confiere resistencia al herbicida clorosulfurón,
que fue usado como marcador de selección. También usaron el promotor EF1a de A. thaliana,
cuya eficiencia ya había sido probada por Van Boxtel et al. (1995), junto con la secuencia
intensificadora llamada W´ derivada del
virus del mosaico del tabaco. Sin embargo, la eficiencia de transformación fue
mayor con el promotor CaMV35S duplicado.
Por
su parte, Van Boxtel (1994) y Van Boxtel
et al. (1995), colocaron al gen
reportero gus
bajo el control de los promotores EF1a, CaMV35S y Ubi I de maíz, encontrando un incremento de la expresión
transitoria con el primero, en comparación a lo observado con los otros dos.
También
se han realizado ensayos con promotores propios del café, incluyendo el
promotor de la α-tubulina (nro. de accesión al Genbank AF363630) y de la proteína de almacenamiento
11S de C. arabica
(nro. de accesión al Genbank AF055300), para dirigir la expresión del gen gus en suspensiones celulares transformadas
por biobalística,
obteniéndose resultados similares en comparación a la expresión observada
al utilizar el promotor CaMV35S, pero con las ventajas que ofrece el uso de
secuencias propias de la planta al nivel de bioseguridad (Rosillo et al. 2003).
En
cuanto a las secuencias terminadoras, se ha utilizado frecuentemente el
terminador de la nopalina sintetasa
NOS de Agrobacterium.
Métodos
utilizados en la transformación genética de café
Como se mencionó, la transformación genética de café se ha llevado a
cabo mediante métodos físicos y biológicos que incluyen Agrobacterium, polietilenglicol, electroporación
y biobalística.
De
Peña (1995) y Carneiro (1999) hacen referencia a la transformación de protoplastos de C. arabica cv. Colombia mediante tratamiento con polietilenglicol, registrándose expresión transitoria del
gen reportero gus
y resistencia a la kanamicina a partir de la
expresión del gen nptII
utilizado como marcador de selección. Sin embargo, no se reporta regeneración
de plantas transformadas. Esto probablemente se deba a la vulnerabilidad de los
protoplastos; en este sentido, Díaz et al. (2004) explican que el cultivo de
protoplastos es la metodología más sofisticada del
cultivo in vitro de plantas por lo
cual representa gran complejidad experimental,
no estando disponible más que para algunas especies y, dentro de ellas,
particularmente en genotipos modelo. Por ello se desarrollaron metodologías alternativas
de transformación directa, como electroporación y
bombardeo de micropartículas o biobalística.
La
transformación de protoplastos de café también se ha
llevado a cabo mediante electroporación. Barton et al. (1991) electroporaron
protoplastos de C.
arabica, reportando la obtención de embriones
somáticos transformados y la regeneración de plantas que fueron seleccionadas
en base a la resistencia a kanamicina. Sin embargo,
estas plántulas no sobrevivieron debido a un sistema radicular pobremente
desarrollado. Van Boxtel (1994) señala la expresión
del gen gus en distintos genotipos electroporados de café, pero sin la sobrevivencia del
material regenerado. Por otra parte,
Fernández y Menéndez (2003) optimizaron los parámetros de transformación
de tejidos intactos de café mediante electroporación,
reportando la regeneración del material transformado con resultados positivos
en la reacción GUS y en
La
transformación por biobalística se ha llevado a cabo
con los genes gus, bar y ahas,
con resultados positivos en la expresión transitoria del gen gus y en
Rosillo et al. (2003) bombardearon suspensiones celulares de C. arabica cv.
Colombia con plásmidos de la serie pCAMBIA (Centre for the Application
of Molecular Biology to
International Agriculture-Canberra, Australia),
variando parámetros físicos en la pistola de bombardeo (distancia hasta el explante y presión de helio) y la duración y concentración
de tratamientos osmóticos prebombardeo. Reportan
expresión transitoria del gen reportero gus, la cual
incrementó considerablemente en el material preincubado
durante 4 horas con manitol y sorbitol, bombardeado a 900 psi con una distancia de
Barros et al. (2001) realizaron la transformación mediante biobalística de embriones cigóticos
de C. arabica
con el gen ahas,
logrando la selección del material transformado en base a la resistencia al
herbicida Imazapyr, pero tampoco lograron la
obtención de plantas.
Cunha et al.
(2004) señalan la transformación de callo embriogénico de C. arabica utilizando los genes gus y
nptII, con la selección de callo transformado en
base a la resistencia a kanamicina y la regeneración
de plantas que fueron positivas en la expresión transitoria del gen reportero y
en
En cuanto a la transformación por Agrobacterium, se
han utilizado las especies tumefaciens y rhizogenes, utilizando genes propios de estas
bacterias, así como foráneos (gus, nptII, hpt, csr1 y cry1ac). Ocampo y Manzanera (1991) lograron la
infección de hipocótilos de C. arabica germinados de semillas in vitro con A. tumefaciens, sin la regeneración de
plantas. Spiral
et al. (1993) transformaron embriones
somáticos torpedos de C. canephora (a los que se les hizo cortes superficiales
con un bisturí) usando A. rhizogenes portando los genes gus y bar; reportaron la obtención de plantas positivas en la prueba
histoquímica GUS y en
Selección
del material transformado
Esta
selección se produce generalmente a partir de un gen marcador de resistencia a
un antibiótico o a un herbicida, el cual cumple un papel muy importante en el
proceso de transformación genética, ya que le confiere a las células
transformadas, con respecto a las no transformadas, la ventaja de crecer en
presencia del agente de selección correspondiente. Como algunas especies pueden
poseer resistencia natural a un agente de selección dado, es importante escoger
el agente y la magnitud de la presión selectiva adecuados para la especie de
interés, independientemente del sistema de transformación que se utilice.
Van Boxtel et al.
(1997) evaluaron el efecto de 5 agentes de selección, incluyendo resistencia a
herbicidas y a antibióticos (clorosulfurón,
glifosato, glufosinato de amonio, higromicina
y kanamicina) en explantes
de diferentes genotipos de café. Encontraron
que 100 mg L-1 de kanamicina y 3 mg L-1 de glufosinato
inhibieron el crecimiento de suspensiones embriogénicas de C. canephora. Concentraciones mayores a 90 mg L-1
de glifosato no inhibieron el crecimiento del callo o de las suspensiones. Con
la kanamicina la inhibición fue variable, mientras
que la higromicina y el clorosulfurón
causaron una fuerte necrosis en callo. Concluyeron que la sensibilidad a los
agentes selectivos era genotipo dependiente y que el glufosinato
de amonio era el agente más efectivo en la inhibición de la formación y
crecimiento de callo en secciones foliares de C. arabica, Arabusta
(híbrido de C. arabica
y C. canephora
cv. Robusta) y C. canephora,
con ausencia de necrosis tisular; Arabusta mostró la
mayor resistencia a los distintos agentes probados, en tanto que C. canephora mostró la mayor sensibilidad.
Giménez
et al. (1996) evaluaron el nivel de
resistencia a kanamicina de distintos explantes de C. arabica. Encontraron que 25-30 mg L-1 del
antibiótico inhibían la germinación de los embriones y que las hojas se
afectaban con concentraciones más bajas,
mientras que las suspensiones celulares eran prácticamente insensibles
(la inhibición se observó en concentraciones superiores a los 300 mg L-1).
Para el callo, la inhibición se observó al utilizar 100 mg L-1 de kanamicina. Los autores concluyeron que el gen nptII puede ser utilizado como marcador de
selección efectivo en hojas y embriones somáticos de C. arabica, realizando la selección en
medio solidificado con agar. Por su parte,
Hatanaka et
al. (1999) y Ogita et al. (2004) emplearon exitosamente la higromicina
como agente selectivo de embriones somáticos transformados. Leroy
et al. (2000) seleccionaron tejido
embriogénico transformado en base a la resistencia al herbicida clorosulfuron y Ribas et
al. (2005) en base a la resistencia al glufosinato.
En
cuanto a selección positiva, Samson et al. (2004) evaluaron la capacidad de
crecimiento de distintos genotipos de café
en medios con manosa o xilosa como fuente de
carbono. Observaron el crecimiento y la formación de embriones somáticos en
presencia de manosa, pero no en presencia de xilosa,
lo cual señala al gen de la xilosa isomerasa xyla de Streptomyces rubiginosus
como un posible marcador de selección positiva en el mejoramiento de café
mediante transformación genética. Este gen ya ha sido utilizado con éxito en
sistemas de transformación de papa, tabaco y tomate (Bailey y Kaeppler, 2001).
Contenido de
cafeína e ingeniería genética
La
ingeniería genética también ha sido utilizada para modificar el contenido de
cafeína, lo cual es importante considerando la sensibilidad de algunos
consumidores a este alcaloide y que el café descafeinado ha superado el 10% del
café comercializado en el mundo (Silvarolla et al. 2004; NCA 2009). Ogita et al.
(2003) utilizaron la tecnología del ARN de interferencia ARNi
para la obtención de plantas transgénicas con una tasa de síntesis de cafeína
reducida. Las funciones fisiológicas del sistema ARNi
son variadas; actúa como un mecanismo importante en la regulación de la
expresión genética endógena, en el mantenimiento de la población de células
madre embrionarias por medio de procesos desconocidos, como sistema de defensa
contra virus, control de transposones o elementos
genéticos anómalos, a nivel terapéutico para silenciar ARNm
virales y oncogénicos, como herramienta de estudio de la función celular y en
la identificación de genes esenciales en procesos celulares (Ruíz y Muñoz,
2005). Ogita et al. (2003) mediante esta técnica
inhibieron la expresión de un gen (CaMXMT1) que codifica a una de las
enzimas N-metiltransferasas (theobromine
synthasa) involucrada en la biosíntesis de la
cafeína, utilizando 2 vectores ARNi idénticos con el
fragmento espaciador del gen gus bajo el control del promotor CaMV35S y el terminador de
la nopalina sintetasa
NOS. En C. canephora el contenido final de
cafeína se redujo por encima del 70% y en C.
arabica entre un 65-85%.
Pruebas en
campo de plantas transgénicas de café
El
primer reporte de plantas transgénicas de café con una característica
agronómicamente importante (resistencia al minador de la hoja del café)
probadas en invernadero y en campo ha sido realizado por Leroy
et al. (2000). En invernadero
realizaron bioensayos, exponiendo las plantas seleccionadas en base a la
resistencia al agente de selección, la detección de la proteína cry1ac en extractos foliares mediante
Western Blot y la evaluación positiva a nivel de ADN
(PCR y Southern Blot), a
las larvas del insecto, encontrándose una considerable reducción en el número
de minas y en la defoliación en las plantas transgénicas, en comparación a lo
observado en las no transgénicas (plantas controles). Las plantas que mostraron
alta resistencia al minador en las pruebas realizadas en invernadero, fueron
seguidamente evaluadas en campo en
Actualmente no existen medidas regulatorias internacionales para café
modificado genéticamente. Sin embargo, hay un amplio consenso en la industria
cafetalera para evitar su comercialización e incentivar la investigación y
búsqueda de conocimiento en relación con el genoma de café, incluyendo el
análisis funcional de sus genes mediante el uso de metodologías transgénicas (Etienne et al.
2008).
CONCLUSIÓN
La Ingeniería Genética ha permitido
ampliar el campo del mejoramiento vegetal a partir del manejo y la
transferencia de genes de interés, aplicándose especialmente en plantas de
importancia agronómica y comercial, como el café. Esta planta ha sido la base
de estudios y pruebas que incluyen el cultivo in vitro y la transformación genética con métodos físicos y
biológicos, logrando la expresión de genes foráneos (de origen vegetal y
bacteriano) y la modificación de la expresión de genes endógenos (como los que
regulan la maduración del grano y el contenido de cafeína). El fruto de estas
investigaciones puede ser utilizado para incrementar la producción, el
rendimiento y la calidad de esta planta de gran demanda internacional, e
incluso para estimular y potenciar su cultivo en países con tradición
cafetalera, como Venezuela. Sin embargo, es necesaria la creación de un marco
legal y de regulación nacional e internacional para el café transgénico, de
manera que ninguno de los eslabones de la industria cafetalera, desde el
cultivo como tal, pasando por los pequeños, medianos y grandes productores,
hasta llegar al consumidor, se vean perjudicados.
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Página diseñada por Prof. Jesús Rafael Méndez Natera
TABLA DE CONTENIDO DE LA REVISTA CIENTÍFICA UDO
AGRÍCOLA
