Revista Científica UDO Agrícola
Volumen 9. Número 3. Año 2009. Páginas: 700-704
Comparación
de dos equipos de extracción por reflujo en la actividad antibacteriana de los
extractos acuoso, etanólico y clorofórmico de Piper nigrum L.
Comparison of two equipments (teams) of extraction for reflux in the
antimicrobial activity of the extracts watery, ethanolic
and chloroform of Piper nigrum L.
María
CABELLO NAVAS 
1 y Genette BELLOSO MORALES2
1Departamento
de Ciencias, Unidad de Estudios Básicos, Núcleo Monagas, Universidad de Oriente
(UDO), Maturín 6201, estado Monagas, Venezuela y 2 Escuela de Zootecnia,
Programa de Tecnología de los Alimentos, Núcleo Monagas, UDO. E mails:
mcabello20@gmail.com, mc13@latinmail.com y g_belloso@yahoo.com
Autor para correspondencia
|
Recibido:
02/10/2008 |
Fin de
primer arbitraje: 12/02/2009 |
Primera
revisión recibida: 05/08/2009 |
|
Fin de
segundo arbitraje: 29/08/2009 |
Segunda revisión recibida: 07/10/2009 |
Aceptado:
09/10/2009 |
RESUMEN
La industria alimentaria ha empleado a los vegetales (algunas de sus
partes como hojas, tallos, frutos, semillas, como sus infusiones o extractos)
no solo para dar sabor o color a sus productos, sino también como inhibidores
del crecimiento de microorganismos no deseados en alimentos. La pimienta negra
(Piper nigrum L.) es
una de las tantas especias que se encuentra presente en los procesos de
elaboración de productos manufacturados,
sin embargo, son pocos los estudios sobre el efecto antibacteriano de esta
planta, es por ello que en el presente trabajo se determinó el efecto
inhibitorio de extractos acuoso, etanólico y
clorofórmico de semillas de Piper nigrum L. obtenidos por el método de reflujo, contra el
crecimiento de bacterias Gram positivas.
Los extractos se obtuvieron empleando tres solventes (agua, etanol y
cloroformo) utilizando dos equipos (Goldfish y Soxhlet) para el proceso de extracción por reflujo. La
actividad antibacteriana fue evaluada por el método difusión en placa de agar (Kirby-Bauer). Se evaluaron cinco tratamientos, dos equipos
de extracción y tres solventes..El
mayor halo de inhibición lo presentó el extracto etanólico
obtenido en el equipo Goldfish sobre el crecimiento
de Bacillus cereus (18mm), seguido por el mismo extracto pero
empleando el equipo Soxhlet sobre Streptococcus spp. (13mm). El
extracto acuoso no tuvo efecto
antimicrobiano sobre el crecimiento de las bacterias estudiadas. El equipo Goldfish fue más eficiente para la extracción empleando
etanol y el Soxhlet
para la extracción con cloroformo. El
extracto etanólico
obtenido en ambos equipos produjo mayor
efecto inhibitorio sobre: Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Bacillus sp. y Bacillus cereus). Se
aplicó el análisis estadistico de Kruskal–Wallis
y Prueba de Tukey (p ≤ 0,05).
Palabras clave: Piper nigrum, inhibición
antibacteriana, Goldfish, Soxhlet.
ABSTRACT
The food industry has used to the vegetables (some of your parts as
leaves, stems, fruits, seeds, as your extracts not only to give flavor or color
to your products, but also like inhibiting of the growth of microorganisms not
wished in food. The black pepper (Piper nigrum L.) is one of so many spices that one finds
present in the processes of production of manufactured products, nevertheless,
are small the studies on the antibacterial effect of this plant, it is for it
that in this study I determine the inhibitory watery effect of extracts, ethanolic and chloroform of seeds of Piper nigrum L. obtained by the method of
reflux, on the growth of bacteria positive Gram. The extracts of the seeds of
seeds of Piper nigrum
L. were obtained using three solvents (water, ethanol and chloroform) using two
equipments (Goldfish and Soxhlet)
for the process of extraction for reflux. The antibacterial activity was
evaluated by the method proposed by Kirby-Bauer (diffusion in plate of agar).
There were evaluated five treatments (two equipments
x three solvents). There was applied an analysis of Kruskal-Wallis
and Tukey's Test (P<0, 05). The major halo of
inhibition it presented the extract ethanolic
obtained in the equipment Goldfish on the growth of Bacillus cereus (18mm), followed by the same extract but using the
equipment Soxhlet on Streptococcus spp. (13mm). The watery extract did not have
antimicrobial effect on the growth of the studied bacteria. The equipment
Goldfish was more efficient for the extraction using ethanol and the Soxhlet for the extraction with chloroform. The extract ethanolic obtained in both equipments
produced major inhibitory effect on: Enterococcus
spp., Staphylococcus aureus, Bacillus
sp. and Bacillus cereus.
Key words: Piper nigrum, Microbial inhibition, Goldfish, Soxhlet.
INTRODUCCIÓN
Los vegetales, constituyen alimentos
naturales que siempre deben estar presentes en las comidas, debido a que
proporcionan las vitaminas y minerales necesarios para el desarrollo saludable
de los seres vivos. Sin embargo, el descubrimiento de que determinados
alimentos presentan compuestos biológicamente activos y beneficiosos para la
salud, más allá de la alimentación básica, abrió una nueva etapa en la ciencia
de la nutrición. Estas sustancias adicionales, llamados fitoquímicos
se encuentran, de manera natural, en semillas, frutos, hojas, raíces y tallos,
por lo que se estudia su potencial para promover la salud (Bonafine
et al., 2006).
Las plantas no solo se consumen como
alimento por los humanos, sino que en muchas ocasiones se emplean para añadirle
sabor, olor o inhibir la proliferación de microorganismos en los mismos. Con
estos fines se han empleado la planta completa o algunas de sus partes como la
raíz, hojas, tallos, flores, semillas, frutos o extractos obtenidos de ellas.
La actividad antimicrobiana es uno de los efectos intrínsicos
evidentes de dichos extractos contra patógenos de origen alimentario. Su efecto
depende en gran manera de su fuente de origen, método de extracción y el nivel
de sustancias que contiene, de forma individual deben ser utilizados en una
alta concentración para observar efectos comparables con antibióticos (Kamel, 2000).
Bruneton (2001) señala que la pimienta (Piper nigrum L.), es una de las especias más
consumidas en el mundo, se produce en zonas tropicales o subtropicales. Los frutos del pimentero, no se pueden incluir entre los tóxicos, pero no
son raros los incidentes como proyecciones oculares e irritaciones en la boca de los niños. Puede en gran y
menor medida producir edema en las mucosas inducido por la piperina, principal
“principio picante” de la pimienta, provocando asfixia.
Sharma et al., (1984) analizaron el efecto
inhibitorio de extracto clorofórmico de clavo especie, canela, pimienta,
cardamomo y nuez moscada sobre el crecimiento de Aspergillus parasiticus,
encontraron que los extractos de clavo
y canela, mostraron zonas pronunciadas
de inhibición sobre el hongo, mientras
que las sustancias causantes de este efecto inhibitorio, parecieran estar
ausentes en la pimienta negra, cardamomo y nuez moscada al no observarse efecto
inhibitorio cuando eran empleados sus extractos.
Martínez et al., (2006) evaluaron el
efecto inhibitorio y antioxidante de muestras de
polvos de ají chirel (Capsicum annum) y pimienta (Piper nigrum L.), añadidos a chorizos
frescos, almacenados en atmósferas
modificadas, encontraron que la
adición de polvos de pimentón rojo dulce
y ají picante, así como los polvos de pimienta negra y blanca, inducen la
extensión de la vida útil del embutido, dependiendo de la especia y la
concentración usada. Además observaron que la pimienta negra fue la más
apropiada para prolongar el tiempo de almacenamiento del chorizo, por ser más efectiva en la
decoloración y la formación de olor en los chorizos.
Cunico et al., (2004) realizaron un estudio de la actividad antimicrobiana del extracto etanólico de las raíces y partes aéreas de Ottonia martiana Miq.
(Piperaceae) sobre bacterias relacionadas con
infecciones gastrointestinales: Enterococcus faecium, Enterobacter aerogenes y Pseudomonas aeruginosa, utilizando los métodos de difusión en agar.
Los resultados obtenidos mostraron que el extracto etanólico
de O. martiana presentó un alto potencial antibacteriano contra E. faecium,
observándose la presencia de zonas de inhibición, comprobadas por la prueba de
difusión en agar, mientras que no se observó acción antimicrobiana sobre el
resto de las bacterias estudiadas. Cunico et al., (2004) proponen que el efecto
inhibitorio de extractos etanólicos de O. martiana sobre bacterias Gram
positivas como E. faecium debe ser estudiado más
detalladamente con la finalidad de descubrir nuevos agentes antimicrobianos
naturales, como una alternativa en tratamientos en procesos infecciosos.
Garcés et al., (2005) realizaron un trabajo
bibliográfico sobre el rendimiento productivo animal, tras la prohibición de
los antibióticos promotores del crecimiento.
Analizaron las posibles causantes del aumento de algunas zoonosis, así como los agentes causantes de
pérdida en los rendimientos productivos de los pollos de carne. Emplearon
extractos vegetales como estimulantes digestivos, antisépticos, fungicidas y
bactericidas. En sus estudios reportan que los extractos de orégano (Origanum vulgare L.), tomillo (Thymus vulgaris L.), romero (Rosmarinus officinalis),
pimienta (Piper nigrum L.),
salvia (Salvia officinalis L.) y milenrama (Achillea millefolium L.), mostraron efecto antimicrobiano sobre Salmonella ssp., Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium
perfringens y Staphylococcus
aureus. Además relacionaron la presencia de estos
extractos sobre el rendimiento productivo de los pollos (índice de conversión,
velocidad de crecimiento y peso al sacrificio). Los extractos de pimienta
causaron actividad antimicrobiana sobre Enterococcus, E. coli, Pseudomonas, Salmonella y Staphylococcus.
Gölcu et al.,
(2002), quienes evaluaron la actividad
biológica de extractos etanólico y acuoso obtenidos
por el método tipo Soxhlet de Rubia tinctorium L., sobre el crecimiento de Aeromonas hydrophyla, Bacillus megaterium, Corynebacterium xenosis, Pseudomonas aeruginosa, Micrococcus luteus, E. coli, Enterococcus faecalis y S. aureus, mostrando una zona de inhibición de
El objetivo de esta investigación fue comparar el efecto inhibitorio de
los extractos acuoso, etanólico y clorofórmico de
semillas de Piper nigrum L.,
contra el crecimiento de bacterias Gram positivas, empleando dos equipos de
extracción (Goldfish y Soxhlet),
que emplean diferentes cantidades de la especia como de solvente.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Semillas de Piper nigrum L. perteneciente a
Preparación
de extractos
Se prepararon extractos acuosos, etanólicos y clorofórmicos por el método de reflujo
empleando los equipos Goldfish y Soxhlet,
utilizando 3 y
Actividad
antimicrobiana
Para medir el efecto antibacteriano se
utilizaron bacterias Gram positivas; Enterococcus spp., Staphyloccocus aureus, Streptococcus spp., Bacillus sp, Bacillus cereus,
mediante el método de difusión en placa de agar. Se evaluaron cuatro tratamientos (la combinación de los dos
equipos, id est,
Goldfish y Soxhlet y tres
solventes, id est,
agua, etanol y cloroformo.
Análisis
estadístico
Se realizó un análisis no paramétrico de Kruskal-Wallis con tres repeticiones. Para evaluar las diferencias entre los cinco tratamientos
se aplicó la prueba de Comparaciones Múltiples de Tukey a un nivel de significación de 5%.
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
En el cuadro 1 se muestran los resultados
obtenidos en la evaluación de la actividad antibacteriana de los extractos
acuoso, etanólico y clorofórmico de semillas de Piper nigrum L.,
los cuales refieren que al emplear Goldfish y
etanol se observó un mayor halo de
inhibición (18mm) para Bacillus cereus. Para Streptococcus spp., el mayor halo
(13mm) se obtuvo empleando etanol y Soxhlet. El extracto clorofórmico obtenido en ambos equipos
provocó una inhibición de menor tamaño (11mm) para la mayoría de las bacterias.
Aunque con Goldfish
se reportaron los mayores halos de inhibición, solo fueron obtenidos con
etanol, mientras que con el método de Soxhlet se
logró obtener inhibición tanto con etanol como con cloroformo, lo que demuestra
que mientras mayor es la cantidad de muestra empleada, mayor será también la
cantidad del principio activo extraído.
|
Cuadro 1. Diámetro de
inhibición máxima (mm) de extractos acuosos, etanólicos
y clorofórmicos de pimienta (Piper nigrum L.) sobre las bacterias Gram positivas Enterococcus spp. (E), Staphyloccocus aureus (Sa), Streptococcus spp. (S), Bacillus sp. (B) y Bacillus cereus (Bc) utilizando Goldfish y Soxhlet. |
|||||||||
|
|
Diámetro de inhibición máxima (mm)* |
||||||||
|
Bacterias |
Método Goldfish |
Método Soxhlet |
Solvente (sin extractos) |
||||||
|
|
EA |
EE |
EC |
EA |
EE |
EC |
A |
ET |
C |
|
E |
-- |
12 |
-- |
-- |
12 |
11 |
-- |
-- |
-- |
|
Sa |
-- |
15 |
-- |
-- |
-- |
11 |
-- |
-- |
-- |
|
S |
-- |
-- |
11 |
-- |
13 |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
B |
-- |
15 |
-- |
-- |
12 |
11 |
-- |
-- |
-- |
|
Bc |
-- |
18 |
-- |
-- |
12 |
-- |
-- |
-- |
-- |
|
EA:
Extracto acuoso; EE: Extracto etanólico; EC:
Extracto clorofórmico; A: Agua destilada; C: Cloroformo al 99,4%; ET: Etanol
al 99,8%; --
Negativo (sin halo de inhibición). |
|||||||||
El extracto acuoso obtenido por los
métodos de Goldfish y Soxhlet, no reportó inhibición sobre Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus sp. y Bacillus cereus. Se esperaba que al ser el agua
empleada en la mayoría de los productos alimenticios como parte de los líquidos
de cobertura o en alguna de las etapas de los procesos tecnológicos, se podría
emplear como solvente para la extracción de alguno de los compuestos presentes
en la pimienta, sin embargo los resultados demostraron lo contrario. Es posible que este solvente no permite una
disolución de los compuestos bioactivos de las
semillas analizadas o de ser solubles, la concentración en la cual se
encuentran es muy baja para provocar una efecto antimicrobiano.
En el cuadro 2 se muestran los resultados del efecto inhibitorio de los
extractos etanólico y clorofórmico obtenidos
empleando los equipos Goldfish y Soxhlet, medido como
el halo de inhibición sobre el crecimiento de bacterias Gram positivas; Enterococcus spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus sp. y Bacillus cereus.
El extracto acuoso obtenido en ambos equipos no presento efecto
inhibitorio sobre el crecimiento de las bacterias estudiadas.
El análisis de promedios determinó que el extracto etanólico
obtenido por Goldfish tuvo un mayor efecto
inhibitorio del crecimiento sobre Enterococcus spp., S. aureus, Bacillus sp. y Bacillus cereus, superando a los resultados del
extracto clorofórmico obtenidos por ese mismo método, para el mismo grupo de
microorganismos. Para Streptococcus spp., se
observó mayor inhibición con el extracto clorofórmico. Para los extractos obtenidos por Soxhlet se observó mayor inhibición del extracto etanólico sobre el crecimiento de Enterococcus spp.,
Streptococcus
spp., Bacillus sp, y Bacillus cereus.
En el caso de S. aureus el extracto clorofórmico fue el que causo mayor
inhibición. Estos resultados indican que
existen diferencias significativas entre los extractos y los equipos de
extracción sobre el crecimiento de las bacterias (p ≤ 0,05).
Aún cuando el
tiempo de extracción fue igual en ambos
equipos, se puede inferir que existe una especificidad de los extractos la cual
está influenciada por la cantidad de muestra empleada y el volumen de solvente
utilizado. El método de reflujo se basa en obtener metabolitos según la
solubilidad de estos compuestos en el solvente. Sin embargo, de los resultados
obtenidos en esta investigación se puede inferir que con el equipo Goldfish, posiblemente por emplear un reflujo continuo, se
disminuye la pérdida de solvente y con ello los compuestos volátiles, mientras
que en Soxhlet,
su reflujo discontinuo, puede inducir a una pérdida de los compuestos
presentes en la muestra a evaluar.
Los halos de inhibición encontrados en
esta investigación son menores a los reportados por Gölcu et al., (2002) en sus estudios de
extractos etanólico (11-16mm)
y acuoso (12-20mm) obtenidos por el método tipo Soxhlet
de Rubia
tinctorium L. sobre diversos microorganismos. De
igual forma coinciden con los reportados por Sağdiç
et al., (2002) en su estudio con
extractos metanólicos de especias turcas, a cuatro
diluciones diferentes, encontraron que el diámetro de inhibición para el comino
(Cuminum cyminum) estuvo entre 15 -17mm, Hlichrysum compactum Boiss (HC)
(21-28mm), laurel (Laurus nobilis L.) (
Los resultados presentados en el cuadro 2
de esta investigación demuestran que estadísticamente, los
extractos obtenidos por Goldfish fueron
estadísticamente más significativos para la mayoría de las bacterias evaluadas,
excepto para Streptococcus
spp. , donde Soxhlet fue
estadísticamente superior. Los estudios realizados por Gölcu
et al., (2002) y Sağdiç
et al., (2002) sobre efecto
antimicrobiano de extractos de vegetales sobre el crecimiento de
microorganismos, a pesar de que muestran un efecto positivo del método tipo Soxhlet sobre la
actividad biológica en bacterias, no es comparado con otros equipos de
extracción.
|
Cuadro
2. Prueba de Kruskal-Wallis y prueba de comparación de Tukey para el halo de inhibición de Enterococcus
spp. (E), Staphyloccocus aureus (Sa),
Streptococcus
spp. (S), Bacillus sp. (B) y Bacillus cereus (Bc) causado por los
extractos etanólico y clorofórmico de semillas de pimienta (Piper nigrum L.)
obtenidos por Goldfish y Soxhlet. |
||||||||||
|
Método de extracción |
Bacterias |
|||||||||
|
|
Enterococcus
|
St.
aureus |
Streptococcus |
Bacillus |
B. cereus |
|||||
|
Goldfish etanólico |
19,0 |
A † |
21,0 |
A |
9,0 |
B |
19,5 |
A |
21,5 |
A |
|
Soxhlet clorofórmico |
9,7 |
AB |
14,0 |
AB |
9,0 |
B |
9,5 |
B |
8,5 |
B |
|
Goldfish clorofórmico |
6,5 |
B |
9,0 |
B |
12,5 |
B |
8,0 |
B |
8,5 |
B |
|
Soxhlet etanólico |
14,8 |
AB |
9,0 |
B |
19,5 |
A |
12,9 |
AB |
11,5 |
B |
|
H de Kruskal
Wallis (p ≤ 0,05) † Comparación
Múltiple de Tukey. Letras diferentes indican
promedios estadísticamente diferentes de los rangos (p ≤ 0,05) dentro
de una misma columna |
||||||||||
Los resultados obtenidos en nuestra
investigación difieren con los reportados por Águila et al., (2000) quienes en un estudio preliminar con extracto acuoso
de Calendula officinalis
L. observaron
propiedades bactericidas de los extractos sobre Staphylococcus aureus y S. fecalis,
además determinaron la presencia de flavonoides, saponinas, polisacáridos,
aminoácidos y taninos.
Compuestos con actividad antibacterial han sido reportados por varios investigadores
particularmente, Barre et al.,
(1997), Djoukeng et
al., (2005), Reddy et al., (2001), señalan en sus estudios que los triterpenos
provenientes de Lantana camara inhibieron el crecimiento de Staphylococcus aureus y Salmonela tiphy;
mientras que los triterpenos extraídos de Syzygium guineense inhibieron el crecimiento de Bacillus subtilis. E. coli y Shigella sonnei.
Los resultados obtenidos en esta
investigación coinciden con los reportados por Cabello et al., (2007) para
bacterias Gram negativas (Escherichia coli y Proteus sp.), cuando evaluaron
extractos etanólico y clorofórmico de pimienta negra
(Piper nigrum
L.). Ellos indican en ese estudio que el
método Goldfish empleando etanol tuvo mayor efecto
inhibitorio para ambas bacterias, y el mayor halo de inhibición (15mm) se
observó en E. coli,
mientras que para Proteus
sp. fué
de 13mm. Solo encontraron efecto inhibitorio del extracto clorofórmico obtenido
por Soxhlet para
E. coli
y Proteus
(11 y
Los resultados positivos de inhibición
con el extracto clorofórmico de semillas de pimienta también coinciden con los
reportados por Natarajan et al., (2005) quienes encontraron halos de inhibición entre 7 y
CONCLUSIONES
El extracto etanólico obtenido de semillas de pimienta negra (Piper nigrum L.) utilizando el método de Goldfish causó mayor
efecto sobre la mayoría de las bacterias
Gram positivas estudiadas,
particularmente se observó el mayor halo de inhibición en Bacillus cereus (
El halo de mayor
inhibición (
El efecto del extracto
clorofórmico de semillas de pimienta empleando los métodos de Goldfish y Soxhlet, fue menos efectivo que el extracto etanólico, los halos de inhibición oscilaron entre 11 y
El extracto acuoso obtenido
empleando Goldfish y Soxhlet
no presentaron halos de inhibición, sobre el crecimiento de las bacterias Guam
positivas estudiadas.
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TABLA DE CONTENIDO DE LA REVISTA CIENTÍFICA UDO
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