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Revista Científica UDO Agrícola Volumen 12. Número 1. Año 2012. Páginas: 91-96

 

Actividad antifúngica de extractos de Acacia farnesiana sobre el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

 

Antifungal activity of Acacia farnesiana extracts on the in vitro growth of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

 

Aida Tania RODRÍGUEZ PEDROSO¹, Miguel A. RAMÍREZ ARREBATO¹, Silvia BAUTISTA BAÑOS², Ariel CRUZ TRIANA¹ y Deyanira RIVERO¹

 

¹Unidad de Ciencia y Técnica de Base Los Palacios, Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), Km. 1,5 Carretera La Francia, Los Palacios, Pinar del Río, CP 22900, Cuba y ²Centro de Desarrollo de Productos Bióticos, Instituto Politécnico Nacional, Km. 8,5 Carretera Yautepec-Jojutla, San Isidro, Yautepec, Morelos, México CP 62731, México.  E-mail: atania@inca.edu.cu   Autor para correspondencia

 

 

RESUMEN

 

Las plantas producen compuestos con propiedades antimicrobianas que pueden ser empleadas en el control de enfermedades que afectan a cultivos de interés económico. La obtención de los extractos vegetales y el estudio de sus compuestos activos propician su empleo contra diferentes hongos. En este trabajo se obtuvieron dos  extractos de la especie vegetal Acacia farnesiana: uno hidroalcohólico (Extracto A)  y otro acuoso (ExtractoB). Se le determinó el efecto antifúngico de ambos extractos sobre el hongo Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici mediante el porcentaje de inhibición del crecimiento micelial en el tiempo y se le realizó el correspondiente análisis químico cualitativo. Los extractos mostraron más de un 90% de inhibición del crecimiento micelial desde la primera evaluación realizada a las 72h después de la inoculación. Además, se comprobó efecto fungicida de los mismos sobre el hongo. Adicionalmente, se observó la presencia de metabolitos con actividad antimicrobiana reconocida como: flavonoides, taninos, fenoles, alcaloides y saponinas. 

 

Palabras clave: Fusarium, extractos vegetales, metabolitos secundarios, Acacia farnesiana, antimicrobiana.

 

ABSTRACT

 

Plants produce compounds with antimicrobial properties that can be used for diseases control that affect cultivars of economic interest. The obtention of the vegetal extracts and identification of their active compounds will allow their application against different fungi.  In this work we received two vegetal extracts: one aqueous-alcoholic and other plant species Acacia farnesiana. The antifungal activities were evaluated of the two extracts on the fungus Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici by the percentage of inhibition of mycelial growth in time and were performed for phytochemical analysis. Both extracts showed more 90% of inhibition micelial growth in the first evaluation (72 hours) after of the inoculation. So, the vegetal extracts showed fungicide effect on the fungus. Besides, two vegetal extracts showed the presence of metabolites to microbial activity known as flavonoids, tannins, phenols, alkaloids and saponins.

 

Key words: Fusarium, vegetal extracts, secondary metabolites, Acacia farnesiana, antimicrobial.

 

 

INTRODUCCIÓN

 

El control de hongos fitopatógenos a través de fungicidas sintéticos continúa siendo la medida fitotécnica más importante para aumentar los rendimientos de los cultivos (Bernal et al. 2005). Sin embargo, la utilización masiva y a veces indiscriminada de estos productos ha incrementado la población de organismos fitopatógenos resistentes (Cooke et al. 2003; Leroux, 2003 y Guerrero et al. 2007).

 

El marco de una agricultura sostenible ha llevado a investigadores de todo el mundo a buscar nuevos compuestos para el control de enfermedades cuya actividad y seguridad ambiental sea adecuada (Wilson et al.1999; Bautista et al. 2004; Boyraz y Ozcan, 2006, Hernández et al. 2007 e Igbinosa et al. 2009). En este sentido, se han desarrollado alternativas naturales, entre las cuales se encuentra el uso de extractos vegetales, con los que se han obtenido resultados prometedores. Además, los extractos vegetales tienen las ventajas de poseer un origen biológico, ser degradables y manifestar un mínimo impacto negativo sobre la salud humana y el medio ambiente (Bravo et al. 2000 y Barrera y Bautista, 2008). Diversos autores han demostrado la actividad antimicrobiana de diferentes extractos de plantas in vitro e in vivo (Rodríguez et al. 2000; Bautista et al. 2004; Cárdenas et al. 2005,  Alzate et al. 2009 y Garduno et al. 2010). 

 

El empleo de plantas que son consideradas malezas, tal como la Acacia farnesiana que compite con los cultivos de importancia económica por los nutrientes, luz solar y el espacio, resultan una fuente económica y muy importante de obtención de extractos vegetales con actividad antimicrobiana.

 

Por otra parte, se ha descrito que el hongo Fusarium oxysporum  f. sp. lycopersici ocasiona grandes daños al cultivo del tomate y los tratamientos químicos en ocasiones resultan ineficaces. Es por ello, que  el presente trabajo tiene como objetivos determinar la actividad antifúngica de dos extractos de Acacia farnesiana sobre F. oxysporum f. sp.  y realizar el análisis químico cualitativo de los compuestos.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

 

Material vegetal

 

Se utilizaron hojas plenamente desarrolladas y frescas de la especie Acacia farnesiana, el material vegetal  fue identificado y depositado en el Herbario  EELP de la Unidad Científico Tecnológica de Base de Los Palacios, con un voucher bajo el No AF 001,  las cuales se recolectaron en horas tempranas de la mañana, entre los meses de marzo y abril de 2006 y 2007, en áreas de la Unidad Científico Tecnológica de Base de Los Palacios en Pinar del Río, Cuba.  Una vez cosechadas las hojas se descartaron las dañadas y enfermas. Las hojas seleccionadas se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% y posteriormente se lavaron con agua destilada. Seguidamente, se secaron en estufa con recirculación de aire a una temperatura de 30-35°C hasta haber obtenido tres pesadas constantes. El material deshidratado se molió con un molino manual.

 

Preparación de los extractos

 

Los extractos fueron denominados: Extracto A y Extracto B. Para la preparación del  Extracto A (extracto hidroalcohólico): se pesaron 30 g del material vegetal y se le adicionó 30 mL de alcohol etílico al 30 %. En cuanto al Extracto B (extracto acuoso): se pesaron 30 g del material vegetal se le adicionó 30 mL de agua destilada.

 

Ambos extractos se dejaron reposar durante 72 h a temperatura ambiente, se filtraron a través de papel Whatman No.1 y posteriormente en filtro de fibra de vidrio microporo (Tequida et al., 2002).

 

Condiciones del aislado utilizado

 

El aislamiento empleado fue Fusarium oxysporum f. sp.  (FOL-03) del cepario del laboratorio de Micología del Departamento de Fisiología y Bioquímica Vegetal del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), ubicado en el municipio de San José las Lajas de la provincia de Mayabeque. Se tomó micelio del hongo y  se cultivó sobre el medio de papa-dextrosa-agar (PDA) a pH 5.6 con alternancia de luz y oscuridad (16 y 8 horas respectivamente) y a una temperatura de 26-28 °C durante 7 días.

 

Actividad antifúngica

 

Evaluación del efecto de los extractos sobre el crecimiento micelial

 

Los tratamientos fueron:

 

1.  Control (medio PDA)

 

2.  Extracto A (hidroalcohólico al 30 %)

 

3.  Extracto B (acuoso)

 

El ensayo se llevó a cabo en Placas PETRI, las cuales contenían 20mL del medio PDA, el cual fue esterilizado en autoclave (AESA, Mod. CV 250) durante 15 min. A una presión de 15 lb/pul² a 121^oC. Posteriormente, se le adicionó 5mL de cada extracto por placas, el cual fue distribuido por toda la placa y después se inocularon con un disco de agar que contenía al patógeno de 0.8 cm de diámetro.

 

Ensayo de actividad fungicida

 

Para evaluar el efecto fungicida, se tomó del ensayo anterior las placas donde   no hubo crecimiento micelial del hongo. De ellas, se transfirió el disco de agar que contenía al inoculo a nuevas placas que contenían 20 mL del medio PDA a pH 5.6  y se incubaron con alternancia de luz y oscuridad (16 y 8 horas respectivamente) y a una temperatura de 26-28 °C durante 9 días, hasta que el micelio cubriera toda la placa.

 

Se realizó seguimiento del crecimiento fúngico en ambos ensayos a las 72, 120, 168 y 216 horas después de la inoculación midiendo el diámetro micelial de cada colonia con regla graduada en mm y determinando posteriormente el promedio de los mismos. Se realizaron 5 réplicas por tratamiento y ambos experimentos se repitieron tres veces.

 

Análisis estadístico

 

El porcentaje de inhibición del crecimiento micelial se calculó con respecto al control de medio de cultivo inoculado, el cual se consideró como el 100 % de crecimiento radial o 0 % de inhibición del crecimiento micelial mediante la ecuación:

 

 

Para realizar el análisis estadístico, los datos originales se transformaron  por la fórmula arcsen√%. Los datos obtenidos fueron sometidos a un análisis de varianza y prueba de  Tukey.

 

Análisis químico cualitativo de los extractos

 

A los extractos se les realizó el análisis fitoquímico para metabolitos secundarios según metodología descrita por Trease y Evans (1989) y Harborne (1998). En la Tabla 1, se refieren los diferentes ensayos realizados. 

 

 

Tabla 1. Compuestos químicos a determinar en los extractos (Extracto A y Extracto B) de Acacia farnesiana.
Ensayos	Compuestos
Shinoda	Flavonoides
Fehling	Azúcares reductores
Cloruro Férrico	Fenoles
Gelatina	Taninos
Ninhidrina	Aminoácidos
Lieberman-Burchard	Triterpenos
Bornträger	Quinonas
Mayer	Alcaloides
Espuma	Saponinas
Extracto A: hidroalcohólico al 30 % y Extracto B: acuoso.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

 

En la Tabla 2 se observan los resultados del efecto in vitro de los dos extractos vegetales sobre el hongo.

 

 

 

Tabla 2. Efecto del Extracto A y del Extracto B de Acacia farnesiana sobre el crecimiento micelial de  Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.
Tratamientos	Inhibición del crecimiento micelial (% por horas)
	72		120			168			216
Control	0,0	c		0,0	c		0,0	c	0,0	c
Extracto A	98,0	a		98,5	a		98,8	a	99,0	a
Extracto B	94,0	b		96,4	b		98,1	b	98,2	b
Error Estándar	0,059		0,067			0,03			0,02
Letras diferentes indican promedios estadísticamente diferentes según Prueba de Tukey (p ≤ 0,05). Extracto A: hidroalcohólico al 30 % y Extracto B: acuoso

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Como puede apreciarse, todos los tratamientos difirieron entre sí, los correspondientes al Extracto A y al Extracto B fueron las que tuvieron efecto inhibitorio sobre el crecimiento del hongo; siendo el Extracto A el que mostró mayor efecto, aunque el porcentaje de inhibición fue mayor del 95 % en ambas fracciones.  En el caso del control mostró un crecimiento normal, por lo tanto su porcentaje de inhibición fue de un 0 %.

 

Actividad fungicida

 

En cuanto a la actividad fungicida de los Extractos A y B, se pudo observar que todos los micelios provenientes de los tratamientos con los extractos no tuvieron crecimiento; sin embargo, el tratamiento control si creció hasta cubrir la placa, demostrando así el efecto biocida de los mismos sobre el patógeno utilizado y en las condiciones que se realizó el experimento.

 

Análisis químico cualitativo de los extractos

 

En la tabla 3 se muestran los resultados del tamizaje fitoquímico realizado a los extractos A y B de Acacia farnesiana, el cual nos ayuda a determinar los principales grupos químicos presentes.

 

 

 

 

Al analizar los resultados del tamizaje fitoquímico, se pudieron observar los diferentes metabolitos secundarios presentes en ambos extractos. Este estudio comprendió un conjunto de ensayos y técnicas sencillas, que aunque no brindan un resultado concluyente, debido a diversos factores influyentes,  sí nos dan una idea general sobre la composición química de la planta (Pérez e Iannacone, 2008).

 

Es importante destacar, que los dos extractos contenían: flavonoides, azúcares, fenoles, taninos, alcaloides y saponinas, aunque en el extracto hidroalcohólico (Extracto A) la presencia de estos compuestos era más fuerte que en el extracto acuoso (Extracto B). Este resultado pudo deberse a la polaridad del solvente y a la capacidad del mismo para disolver los diferentes compuestos químicos (Cowan, 1999).

 

En el caso del extracto alcohólico, en el ensayo de Fehling se observó un precipitado rojo perfectamente distinguible indicativo de la presencia de compuestos reductores, iguales resultados se obtuvieron para los ensayos de Lieberman-Burchard, Ninhidrina, Cloruro férrico, Shinoda, indicando la presencia de triterpenos y/o esteroides, aminoácidos libres o aminas en general, taninos y/o compuestos fenólico y flavonoides, respectivamente. Cada uno de estos ensayos mostró las coloraciones correspondientes que permitieron evaluar los resultados y emitir los criterios expuestos anteriormente.

La inhibición del crecimiento micelial mostrada por los dos extractos se debe a la presencia de algunos de estos metabolitos como los flavonoides, que son un grupo de compuestos con amplio rango de actividad biológica, que incluye la actividad antimicrobiana, antiviral, atrayente de polinizadores, protectora de las plantas contra la luz ultravioleta, antioxidantes y antibacterial (Maneemegali y Naveen, 2010). Autores como Seigler (2003) y Sánchez et al. 2010 han identificado a los flavonoides presente en plantas de la misma familia como responsables de la actividad antimicrobiana sobre otros microorganismos fitopatógenos. Otros de los metabolitos con actividad antimicrobiana son los terpenos, taninos, saponinas. (Okigbo e Iqwe, 2007).

 

También se plantea que el mecanismo de acción de estos compuestos  es variable sobre los microorganismos. Por ejemplo: los taninos inhiben la síntesis de proteínas en la célula (Shimada, 2006). Por su parte, los fenoles producen inhibición enzimática por oxidación de compuestos. El modo de acción de los terpenos no ha sido dilucidado por completo pero se postula que pueden causar rompimiento de la membrana a través de los compuestos lipofílicos. De los alcaloides se dice que se intercalan con el DNA, y de las lectinas y polipéptidos se conocen que pueden formar canales iónicos en la membrana microbiana o causar inhibición competitiva por adhesión de proteínas microbianas a los polisacáridos receptores del hospedero (Cowan, 1999).

 

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se hace necesario aislar e identificar los compuestos activos que presenta esta planta y considerar los cambios morfológicos, moleculares y bioquímicos que estos pueden causar sobre F. oxysporum f. sp.  También estudiar la posibilidad de utilizarlos como principios activos en formulaciones para el control de este patógeno y así minimizar las pérdidas que éste puede causar. De esta forma, se aumentará la productividad al reducir los costos por el empleo de agroquímicos, con una notable disminución de la contaminación ambiental. 

 

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