Revista
Científica UDO Agrícola Volumen 11. Número 1. Año
2011. Páginas: 89-96
Detección de marcadores microsatélites asociados con la resistencia a Curvularia pallescens (Boedijn) en maíz
Detection of SSR markers
associated with the resistance to Curvularia pallescens (Boedijn) in maize
Hilda FERNÁNDEZ 1
1Instituto Nacional de
Investigaciones Agrícolas (INIA). Centro Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (CENIAP). Apartado 4653, Maracay, estado Aragua, Venezuela, 2Planta de Bioinsumos,
INIA. Turmero, estado Aragua y 3Universidad
Central de Venezuela, Facultad de Agronomía. Maracay, estado Aragua. E-mail: hfernandez@inia.gob.ve
|
Recibido: 16/03/2010 |
Fin de primer arbitraje:
23/09/2010 |
Primera revisión recibida: 28/12/2011 |
Aceptado: 30/12/2011 |
RESUMEN
El cultivo del maíz
en Venezuela es frecuentemente afectado por un grupo de enfermedades foliares,
entre las cuales se encuentra la mancha
blanca causada por el hongo Curvularia pallescens. Esta enfermedad aparece en el período
reproductivo de la planta, afectando de manera significativa el rendimiento en
granos. Con la finalidad de identificar marcadores SSR, o simple sequence repeat por sus siglas en inglés, asociados con la resistencia a la mancha
blanca causada por C. pallescens
en maíz, se realizó un análisis de segregantes
agrupados o Bulked Segregant Analysis, BSA por su
siglas en inglés, asistido con marcadores SSR. Para ello se utilizó una
población F2 integrada por 100 plantas derivadas de un cruce entre
dos líneas elites (resistente x susceptible), previamente inoculadas con
aislamientos puros de C. pallescens. Para
el análisis BSA se formaron dos grupos contrastantes (resistentes y
susceptibles), los cuales fueron evaluados junto a los dos progenitores con 50
loci SSR. De estos loci solo cuatro resultaron polimórficos, tres de
los 46 restantes no amplificaron y 43 de ellos no presentaron bandas
diferenciales. Para determinar la asociación entre los loci polimórficos y la
resistencia, se empleó una prueba basada en el estadístico chi-cuadrado de
independencia (p=0,05), encontrándose asociación entre el locus Bnlg439 y la
resistencia a C. pallescens.
Adicionalmente, a partir de los resultados de los análisis estadísticos, se
calcularon los valores predictivos, especificidad y sensibilidad de los cinco
loci polimórficos, entre los cuales
el marcador Bnlg439 presentó el valor más alto de especificidad (76%), y el mayor valor predictivo positivo (85%).
Palabras clave: mancha blanca, BSA, SSR polimórficos, resistencia.
ABSTRACT
The
Maize crop in Venezuela is frequently affected by a group of foliar diseases,
among which one finds the white spot caused by the fungus Curvularia pallescens. This disease appears in the
plant reproductive stage, affecting grain yield considerably. With the purpose
of identifying SSR (simple sequence repeat) markers associated with resistance
to white spot in maize, we performed a Bulked Segregant Analysis (BSA) assisted
with SSR markers. We used an F2 population comprised by 100 plants,
derived from a cross between two lines (resistant x susceptible), which were
previously inoculated with pure isolates of C.
pallescens. Using the BSA methodology two
contrasting groups (resistant and susceptible) were formed, which were
evaluated along with their parents with 50 pairs of SSR loci. Only four of the
50 loci evaluated resulted polymorphic, three of the remaining 45 did not
amplified, and 43 of them did not show differential bands with the parents or the
contrasting groups. To determine the association between the polymorphic loci
and resistance, a Chi-square test of independence was applied (p=0.05) finding
Bnlg439 locus associated with resistance to C.
pallescens. Additionally, from the results of the
statistical analyses, we calculated predictive values, specificity and
sensibility of the 5 polymorphic loci, among
which Bnlg439 marker presented the highest specificity value (76%), and
positive predictive value (85%).
Key words: White spot, BSA, polymorphic SSR, resistance.
INTRODUCCIÓN
El
rendimiento y la producción del maíz en Venezuela se ven afectados por un grupo de enfermedades foliares, que se
presentan todos los años en zonas cálidas y con alta humedad relativa, como es
el caso del estado Portuguesa, donde destaca la mancha blanca, causada por el
hongo C. pallescens. La mayoría de los
cultivares sembrados en el país son susceptibles a la enfermedad y debido al
área foliar afectada pueden llegar a causar pérdidas importantes en la
producción (Pineda 1992).
Con relación a los marcadores microsatélites o SSR
empleados en este estudio, los mismos han
sido utilizados por diversos autores para evaluar enfermedades en maíz. Chen et al.
(2003), estudiaron el tizón del sur, una enfermedad destructiva en maíz,
mediante un análisis de familias segregantes con
marcadores SSR; Nair et al (2001), utilizando marcadores
SSR estudiaron el mildiú lanoso (SDM)
del sorgo y otra forma severa del mildiú lanoso del estado de Rajasthan en la India denominado (RDM) en 47 líneas de
maíz; Nair et
al. (2005), también realizaron un estudio de la misma enfermedad por medio
de un análisis de locus de características cuantitativas o QTL vía SSR, llevado a cabo sobre una
población de retrocruza; Wu
et al. (2002), evaluaron con 87 pares de marcadores SSR el mosaico enanizante MDMV-V del maíz en
una población F2; Danson et al. (2006) usaron 52 marcadores SSR
para estudiar la resistencia al virus
del rayado en híbridos de maíz.
El análisis de segregantes agrupados o BSA,
utilizado también en este trabajo, fue desarrollado por Michelmore
et al. (1991) y su uso conjuntamente con las técnicas
basadas en marcadores moleculares han hecho posible la identificación de
QTL responsables de la resistencia a
enfermedades de las plantas (Pérez-Enciso, 1998). El objetivo de este estudio fue la identificación de
marcadores SSR asociados al carácter de resistencia a la mancha blanca causada
por C. pallescens
en maíz, susceptibles de ser utilizados
en un programa de mejoramiento asistido por marcadores moleculares, que
involucren poblaciones relacionadas
genéticamente con la utilizada en este trabajo.
MATERIALES Y
METODOS
Material
Vegetal
El estudio se efectuó en una
población F2 integrada por 100 plantas, obtenida por autofecundación del hibrido
resultante del cruce entre las líneas
elites 05LEB013 resistente y la línea
05LEB004 susceptible al patógeno
estudiado. Tanto las líneas parentales, como las poblaciones F1 y F2,
fueron generadas en el Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA),
Maracay, edo. Aragua.
Evaluación
fenotípica de la resistencia a C.
pallescens y conformación de los grupos
contrastantes para el análisis BSA
Bajo condiciones de invernadero se evaluaron 200 plantas de la población F2, para ello a
los 30 días después de siembra se
inocularon con aislamientos puros del patógeno en estudio, manteniendo juntas
tanto las plantas tolerantes como las susceptibles, hasta el final del
experimento. Las inoculaciones fueron efectuadas con una asperjadora manual, a
una concentración de 6.0 x 104 conidios/cc, a razón de tres
aspersiones por cada hilera de plantas. Ocho días después de la inoculación se
evaluó la reacción de las plantas frente al patógeno y con la ayuda
de una escala visual de severidad de la
enfermedad (James, 1971) se
establecieron 6 categorías o clases: altamente resistentes, resistentes,
moderadamente resistentes, susceptibles, moderadamente susceptibles y altamente
susceptibles, (Cuadro 1).
|
Cuadro 1. Categorías definidas y porcentaje de rangos de severidad según la escala
utilizada |
||||||
|
|
Rangos (%) |
|||||
|
Categorías |
Altamente Resistente |
Resistente |
Moderadamente Resistente |
Moderadamente Susceptible |
Susceptible |
Altamente Susceptible |
|
1 |
0% |
|
|
|
|
|
|
2 |
|
1-5% |
|
|
|
|
|
3 |
|
|
6-15% |
|
|
|
|
4 |
|
|
|
16-25% |
|
|
|
5 |
|
|
|
|
26-40% |
|
|
6 |
|
|
|
|
|
>40% |
Para el análisis BSA, los grupos
fueron conformados siguiendo los
criterios utilizados por Quarrie et al., (1999) para marcadores codominantes, por lo tanto
ambos grupos, resistentes y susceptibles estuvieron integrados por 34
individuos cada uno.
Extracción,
verificación y cuantificación del ADN
El ADN de las dos líneas
progenitoras y el de cada uno de los individuos de los dos grupos
contrastantes, fue aislado usando el protocolo de Doyle
and Doyle (1990), con pequeñas modificaciones, que
consistieron en agregar 0,01g de bisulfito sódico y polivinil
pirrolidona (PVP), para prevenir la oxidación al
momento de la maceración con nitrógeno liquido. Luego se procedió a verificar
la calidad en geles de agarosa al 0,8%. La cuantificación se efectuó mediante
lecturas con un equipo mini espectrofotómetro marca NANO Drop
y de forma visual usando como referencia
un marcador Lambda de 100 ng de concentración. La concentración de ADN se ajustó
hasta 50 ng/μl.
Análisis BSA
Para este análisis se mezclaron volúmenes
iguales del ADN de los individuos resistentes y susceptibles por separado (Michelmore et al.1991, Quarrie et al.1999).
Ambos grupos de ADN y las dos líneas parentales fueron analizados utilizando 50
pares de marcadores SSR (Cuadro 2), distribuidos en todo el genoma del maíz, y
obtenidos de la base de datos (Maize Data Gen Bank:
http://www.maizegdb.org). Las amplificaciones de los loci microsatélites fueron
efectuadas en un volumen total de 15 μl, con la mezcla de reacción
compuesta por 50ng de ADN,
|
Cuadro 2. Loci SSR utilizados para evaluar la
población F2. |
|
|
Cromosoma |
Marcadores
SSR |
|
1 |
phi037, bnlg439, bnlg1083, bnlg1484, phi227562 |
|
2 |
bnlg125, phi127, phi083, bnlg1045, phi101049,
umc1555 |
|
3 |
umc1594, bnlg1601, phi036, umc1136, phi053 |
|
4 |
dupssr34, mmc0321, phi06, umc1943, phi093 |
|
5 |
bnlg105,
umc1792, bnlg2323, phi109188 |
|
6 |
umc1014, umc1143, phi031, bnlg391, phi078 |
|
7 |
umc1066, umc1642, bnlg1367, phi057, phi116, phi112 |
|
8 |
bnlg2181, bnlg1031, phi121, phi015, bnlg1194 |
|
9 |
umc1657, bnlg1288, phi022, bnlg1730, phi065 |
|
10 |
phi117,
umc1152, umc1196, phi 063 |
Electroforesis
Los productos de amplificación
fueron separados por electroforesis en geles de agarosa MICROPOR (PROMEGA) al
3%, y teñidos con bromuro de etidio a una concentración de 0,5ug/ml, durante
tres horas a 100 voltios constantes. Para la visualización de las bandas se
utilizó el equipo analizador de geles CHEMI-DOC BIO-RAD, software Quantity One
versión 4.2, empleándose el marcador de peso molecular de 25 pb PROMEGA como referencia.
Selección de marcadores polimórficos
Fueron considerados como
polimórficos, aquellos marcadores que presentaron diferencias en la migración
de la banda de cada uno de los padres y grupos contrastantes.
Evaluación
molecular de la población F2 con
los marcadores SSR polimórficos
Para esta evaluación los 100 individuos de la
población F2, fueron analizados con los marcadores polimórficos.
Tanto para las amplificaciones de los marcadores SSR polimórficos como para la
electroforesis se procedió de la forma
descrita anteriormente para el
análisis BSA.
Registro
de datos
Con los datos obtenidos a partir
de la lectura de los geles se construyó
una matriz de genotipage, la cual estuvo constituida por la asignación de
genotipos, donde de forma hipotética, se asignó el genotipo (aa) para los individuos con una banda en igual posición que
el padre resistente, (ab) para los individuos heterocigotos que presentaban dos
bandas en igual posición tanto para el padre resistente como para el padre
susceptible y (bb) para los individuos con una banda
en igual posición que el padre susceptible.
Segregación de los marcadores polimórficos
Mediante el programa MAPDISTO
XLS, versión 1.6.0. Se efectuó una prueba de bondad de
ajuste χ2, a fin de verificar cuanto de las proporciones
observadas por los cinco marcadores polimórficos se desviaron
significativamente de las mendelianas
esperadas para una población F2. La hipótesis nula fue (Ho)
fue: hay segregación mendeliana si la
desviación del marcador resulta no
significativa. La regla de decisión fue: en aquellos marcadores donde la
segregación resultó no significativa, se acepta la hipótesis nula, puesto que
los marcadores segregaron para las proporciones mendelianas esperadas (1:2:1).
Por el contrario en los que la segregación
resultó significativa, se rechaza la hipótesis nula, dado que los
marcadores no segregaron de acuerdo a las proporciones mendelianas esperadas
para una población F2.
Asociación
entre los marcadores polimórficos y respuesta fenotípica de la población F2.
Para determinar la asociación entre los marcadores y la
respuesta fenotípica a C. pallescens, se efectuó una prueba de independencia
basada en el estadístico chi-cuadrado (p=0,05),
utilizando la hoja de cálculo de Microsoft® Excel 2003. La hipótesis nula (Ho)
fue: no hay asociación entre el marcador molecular y la resistencia. La regla
de decisión acepta la hipótesis nula, si el valor de χ2
calculado es menor que el valor de
χ2 tabulado.
Sensibilidad
y especificidad de los marcadores SSR
polimórficos
La validez de los marcadores y la seguridad al
utilizarlos, se determinaron con base a lo reportado en el Cuadro 3, a partir
del cual fue posible determinar sensibilidad (SE), especificidad (ES), falsos
positivos (FP), falsos negativos (FN), valor predictivo positivo (VPP) y valor
predictivo negativo (VPN) para los marcadores asociados con la resistencia
(Cuadro 4).
|
Cuadro 3. Evaluación de los Marcadores SSR polimórficos y respuesta de la población F2. |
|||
|
|
Respuesta de la población F2 |
||
|
Evaluación del Marcador |
Susceptible (S) |
Resistente (R) |
Total |
|
Negativo |
A (bb) |
B |
A+B |
|
Positivo |
C |
D (aa) |
C+D |
|
Total |
A+C |
B+D |
A+B+C+D |
|
Cuadro
4. Formulas derivadas del Cuadro 3, para calcular los parámetros que
determinan validez y seguridad de los marcadores asociados con la
resistencia. |
|
|
Parámetro |
Formula |
|
Especificidad |
ES= A/(A+C) |
|
Sensibilidad |
SE = D/(B+D) |
|
Falsos positivos |
FP= C/(A+C) |
|
Falsos negativos |
FN= B/B+D) |
|
Valor predictivo positivo |
VPP = D/(C+D) |
|
Valor predictivo negativo |
VPN=A/(A+B) |
Estos valores permiten conocer la
probabilidad de obtener un resultado concreto
(verdaderos positivos o verdaderos negativos) en función de la verdadera
respuesta de cada genotipo con respecto a la presencia de la banda evaluada.
Luego de calcular estos valores, se determinó el porcentaje de falsos positivos
y negativos al hacer uso de estos marcadores candidatos en la población F2
evaluada (Fernández y Díaz, 2003).
Además, se determinó la seguridad
de utilizar estos marcadores, calculando los valores predictivos de un
resultado positivo o negativo, que dependen directamente de la frecuencia del
marcador en la población evaluada (Fernández y Díaz, 2003). Estos valores
permiten conocer cuál es la probabilidad que un individuo fenotípicamente
resistente tenga el marcador, y aquel fenotípicamente susceptible no lo tenga.
Se consideraron
individuos resistentes o verdaderos
positivos para la presencia del marcador asociado con la resistencia,
aquellos que presentaron el genotipo (aa) y no
presentaron síntomas. Por el contrario, se consideraron individuos susceptibles
o verdaderos negativos para la presencia del marcador, a aquellos que
presentaron el genotipo (bb) y presentaron síntomas.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis
de Grupos Segregantes (BSA)
El análisis BSA permitió identificar cuatro loci SSR polimórficos para la resistencia
a la enfermedad, estos fueron: bnlg1083, phi037, bnlg1601, y bnlg439;
detectando entre ellos diferentes tipos de polimorfismo, expresado por la
diferente migración de bandas para cada parental, y grupos contrastantes, como
se aprecia en la Figura 1.
Figura 1. Polimorfismos presentados por
los loci
bnlg1083, phi037, bnlg1601 y bnlg439, con los parentales y grupos
contrastantes BSA (M= marcador de peso molecular 25 pb,
R = padre resistente, RB = grupo
resistente, S = padre susceptible y Sb =
grupo susceptible).
Comportamiento
de los marcadores SSR utilizados
De los 50 loci SSR evaluados con los padres y ambos grupos
segregantes, solo cuatro resultaron polimórficos, tres de los 46 restantes
no amplificaron y 43 de ellos no presentaron bandas diferenciales tanto con los
padres como para los grupos contrastantes. Los cuatros marcadores polimórficos revelaron evidente polimorfismo entre las bandas del parental
resistente y susceptible y cada grupo
contrastante, (Figura 1). Del
comportamiento de estos loci, se
puede observar que tanto el grupo resistente (RB) como el susceptible (Sb)
presentaron un patrón de bandas idéntico al respectivo parental, lo que permite
deducir que las bandas que presenta cada grupo contrastante fueron heredadas de
cada parental.
Segregación
de los marcadores polimórficos y
datos fenotípicos de la resistencia en la población F2
Con la prueba de bondad de ajuste χ2 efectuada se
detectó que en tres de los marcadores
polimórficos el Bnlg 1083, Bnlg1601 y el Bnlg439 la segregación fue no significativa, es decir se
acepta la hipótesis nula, puesto que las frecuencias se
ajustaron a la segregación mendeliana
correspondiente a la proporción 1:2:1,
lo que sugiere que la herencia de la
resistencia a C. pallescenses es de tipo monogénico.
Por el contrario, en el marcador Phi037 la segregación fue significativa y en
este caso se rechaza la hipótesis nula, puesto que las frecuencias no se
ajustaron a las proporciones mendelianas esperadas (Cuadro 5). Marcadores
moleculares que mostraron desviaciones de la segregación mendeliana han sido
reportados en maíz (Bentolila et al. 1992; Gardiner et al.
1993; Sibov et
al. 2003, Yan et
al. 2003) y en otras especies de plantas
(Konishi et al.
1990; Faris et
al. 1998). De igual modo, el análisis de los datos fenotípicos (datos no
mostrados) de la evaluación de la
resistencia, presentó segregación mendeliana para un gen dominante 3:1 de genotipos resistentes y susceptibles,
lo que corrobora lo observado con los tres marcadores polimórficos. Resistencia
monogénica ha sido reportada para otros patógenos en
plantas; Yang et al. (2004) en
un estudio similar, encontraron un gen dominante que controla la resistencia a Fusarium graminearum
Schw en maíz; igualmente, en maíz Yang et al.,
(2005) usando marcadores SSR y RFLP
detectaron el gen Rpi1 que controla la resistencia a Pythium
inflatum; y Li et al. (1998) mediante
marcadores AFLPs
determinaron el alelo R2 que confiere resistencia a Phytopthora
infestans en papa.
|
Cuadro 5. Chi-cuadrado
calculado para los marcadores polimórficos y la resistencia en la población F2
y número de genotipos observados de acuerdo a la presencia de las
bandas. n = (100). |
|||||||
|
Nº |
Marcador |
χ2 |
Proporción
1:2:1 |
P |
Hmza |
Hmzb |
Htz |
|
1 |
Phi1083 |
3,44 |
0,179 |
ns |
23 |
33 |
44 |
|
2 |
Phi037 |
30,78 |
0,000 |
*** |
43 |
34 |
23 |
|
3 |
Bnlg1601 |
5,28 |
0,071 |
ns |
26 |
34 |
40 |
|
4 |
Bnlg439 |
2,72 |
0,256 |
ns |
32 |
24 |
44 |
|
6 |
Resistencia |
4,38 |
0,111 |
ns |
34 |
21 |
45 |
|
Hmza
= homocigotos resistentes (aa) Hmzb = homocigotos susceptibles (bb) htz = heterocigotos (ab) *** Significativo (p ≤ 0,05)
ns : No significativo (p > 0,05) |
|||||||
Asociación
entre los marcadores polimórficos y respuesta fenotípica de la población F2
Como se presenta en el Cuadro 6,
la prueba χ2 de independencia permitió
determinar la asociación entre el locus
Bnlg439 y la resistencia a C. pallescens. Para este locus, el valor de χ2calculado (10,84) fue
evidentemente mayor que el tabulado (3,84), lo que permitió rechazar la hipótesis nula (Ho). Varios autores han reportado
diferentes tipos de marcadores asociados con resistencia a enfermedades en
plantas; Hurtado et al. (2004) en un trabajo similar encontraron un marcador SSR
asociado a la resistencia a Xanthomonas axonopodis pv manihotis en yuca; Kozhukhova et al. (2007) detectaron un marcador codominante
en maíz asociado a la resistencia a Fusarium
moniliforme Sheldon var. lactis; (Mittal
M. y Boora KS, 2005) a
Helminthosporium turcicum en sorgo; y Panday, S. et al. (2002) a Colletotrichum
graminícola en sorgo.
|
Cuadro 6. Resultados de la
prueba de χ2 de independencia para los
marcadores SSR utilizados en la evaluación de la población F2. |
||||
|
Marcador SSR |
Bnlg1083 |
Phi037 |
Bnlg1601 |
Bnlg439 |
|
χ2 (0,05; 1gl) Calculado Tabulado |
2,140 3,840 |
0,190 3,840 |
3,180 3,840 |
10,380 3,840 |
|
Probabilidad χ2 |
0,123 |
0,633 |
0,066 |
0,019 |
|
Distribución χ2 |
0,143 |
0,659 |
0,074 |
0,013 |
|
Especificidad (%) |
48 |
43 |
72 |
76 |
|
Sensibilidad (%) |
71 |
64 |
56 |
70 |
|
Falsos Positivos (%) |
52 |
57 |
28 |
24 |
|
Falsos Negativos (%) |
29 |
36 |
44 |
30 |
|
Valor Predictivo (+) (%) |
66 |
64 |
75 |
85 |
|
Valor Predictivo (-) (%) |
55 |
43 |
52 |
53 |
Sensibilidad
y especificidad de los cuatro marcadores
SSR polimórficos
Así mismo, el marcador Bnlg 439 presentó el valor más alto de especificidad,
indicando que el 76% de los individuos evaluados con este marcador presentaron
la banda o alelos relacionados con la resistencia (aa)
y la expresaron fenotípicamente, o sea, no presentaron síntomas; por el
contrario, el 24% fueron falsos positivos puesto que presentaron la banda
relacionada con la resistencia (aa) pero fenotípicamente no lo expresaron, es decir, se
comportaron como susceptibles. Además, este marcador presentó el mayor valor
predictivo positivo (85%), lo que sugiere alta frecuencia
del mismo en la población evaluada.
CONCLUSIONES
·
El análisis BSA
permitió detectar cuatro loci polimórficos
para el carácter de resistencia, de los cuales solo el Bnlg439 presentó
asociación con la misma, esto pudiera estar indicando que este marcador está
ubicado más cerca de la región del cromosoma donde está localizado el gen de
resistencia a C. pallescens.
- Como esperado el marcador Bnlg439 asociado con el
carácter de resistencia, detectó
alto número de individuos resistentes, lo que confirma que el
progenitor masculino (resistente), ha sido capaz de transmitir a la
descendencia los genes de resistencia al patógeno.
- Con base en los valores
predictivos positivos generados por el marcador Bnlg439, es posible
sugerir el uso de este marcador en pruebas diagnosticas para detectar la
presencia de la banda relacionada con la resistencia, en individuos
resistentes de poblaciones
genéticamente relacionadas con el progenitor masculino portador de la
resistencia, usado en este trabajo.
- Los individuos
fenotípicamente resistentes que no presentaron la banda (alelos) de
resistencia, probablemente tuvieron recombinación, durante la cual pudo
haber delección o inserción de algunas regiones
genómicas.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen al INIA y al programa BID FONACIT II (subproyecto
20040004491) por el aporte
financiero para realizar este trabajo. A
Luis Angulo por sus sugerencias y revisión del manuscrito.
LITERATURA CITADA
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Rafael Méndez Natera
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CIENTÍFICA UDO AGRÍCOLA (REGRESO)
