Revista
Científica UDO Agrícola Volumen 10. Número 1. Año 2010. Páginas: 23-28
Regeneración
in vitro de Passiflora edulis f. flavicarpa y Passiflora
quadrangularis utilizando dos tipos de explantes provenientes de plantas adultas y bencilaminopurina
in vitro regeneration of Passiflora
edulis f. flavicarpa and Passiflora
quadrangularis using two explant types from adult plants and bencilaminopurina
Víctor Alejandro OTAHOLA GÓMEZ 
y Mayerlín José DÍAZ GONZÁLEZ
Escuela de Ingeniería Agronómica y Laboratorio de
Biotecnología del Núcleo de Monagas de la Universidad de Oriente. Avenida
Universidad, Campus Los Guaritos, Maturín, 6201, estado Monagas, Venezuela
E-mail: votahola@gmail.com Autor para
correspondencia
|
Recibido:
08/02/2009 |
Fin de
arbitraje: 24/02/2009 |
Revisión
recibida: 20/11/2010 |
Aceptado: 25/11/2010 |
RESUMEN
Se realizaron dos ensayos en el
Laboratorio de Biotecnología del Núcleo de Monagas de la Universidad de Oriente
con el objeto de determinar el efecto de diferentes dosis de bencilaminopurina (BAP) sobre la regeneración in vitro de las especies Passiflora edulis f. flavicarpa
(Pe) y Passiflora quadrangularis (Pq). Un
primer ensayo se realizó utilizando discos foliares, mientras que el segundo se
realizó utilizando yemas axilares, en ambos se utilizaron explantes
provenientes de plantas adultas. Se utilizaron diferentes dosis de BAP (0; 0,5;
1,0; 1,5 y 2,0 mg.l-1), en un medio con macro y micro sales MS con
la adición de 30 mg.l-1 de sacarosa y solidificado con 7 g.l-1
de agar. Se utilizó un diseño estadístico completamente aleatorizado en arreglo
factorial (5 dosis de BAP x 2 especies) con cinco repeticiones. Las diferencias
entre los promedios se encontraron mediante la Prueba de Ámbitos Múltiples de
Duncan al 5%. Se evaluaron los caracteres: Porcentaje
de supervivencia de explantes a los 25; 35 y 45 días
después de la inoculación al utilizar yemas axilares, porcentaje de explantes con formación de brotes a los 25 y 35 días
después de la inoculación y el número de brotes por explantes
a los 45 días. No
se obtuvo regeneración al utilizar discos foliares en ninguna de las dos
especies, mientras que si se obtuvo al utilizar yemas axilares. El BAP indujo
la formación de brotes en todas las dosis utilizadas, Pq
presentó un mayor número de brotes por explante en
las dosis de 1,5 y 2,0 mg.l-1 de BAP con promedios de 6,1 y 7,4
brotes por explante, respectivamente, mientras que en
Pe, el mayor número de brotes
por explante se obtuvo con la dosis de 0,5 mg.l-1
de BAP, con un promedio de 3,0 brotes por explante.
Solamente se presentaron callos en Pq, mientras que en Pe se presentó organogénesis directa.
Palabras clave: Regeneración in vitro,
Pasifloras, tipo de explante, BAP
ABSTRACT
Two experiments were conducted at the Laboratorio
of Biotechnology of Núcleo of Monagas, Universidad de
Oriente in order to determine the effect of different
doses of benzylaminopurine (BAP) on regeneration in vitro of the species Passiflora edulis f. flavicarpa (Pe) and Passiflora quadrangularis (Pq).
The first experiment was conducted using leaf discs, while the second one was
performed using axillary buds in both experiments,
explants from adult plants were used. Different doses of BAP
were used (0.0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 mg.l-1), in a medium
containing macro and micro salts MS with addition of 30 mg.l-1
of sucrose and solidified with 7 gl-1 of agar. A completely
randomized statistical design in factorial arrangement was used (5 doses of BAP
x 2 species) with five replications. Differences among means were found by
using the Duncan's Multiple range test at 5%. The
traits evaluated were: percentage of explant survival at 25, 35 and 45 days
after inoculation using axillary buds, percentage of explants with shoot
formation at 25 and 35 days after inoculation and the number of shoots per
explants after 45 days. No regeneration was obtained using leaf discs in both
species but it was achieved using axillary buds. The BAP induced shoot
formation at all doses used and a greater number of shoots per explant was
found in Pq when
doses of 1.5 and 2.0 mg.l-1 BAP were used with an average of 6.1 and
7.4 shoots per explant, respectively, while in Pe,
the highest number of shoots per explant was obtained with 0.5 mg.l-1
of BAP, with an average of 3.0 shoots per explant. Callus occurred only in Pq, while direct organogenesis was
presented in Pe.
Key words: in vitro
regeneration, passion fruit, type of explant, BAP
INTRODUCCÍON
El
estado Monagas ofrece ventajas comparativas con otros estados de la región
oriental de Venezuela para la producción
y procesamiento de frutales pero problemas de orden agronómico, económicos y
sociales han limitado un mayor desarrollo las siembras de
estos rubros. Siendo las pasifloras uno de los cultivos de mayor importancia y
potencial. Dentro de la familia Passifloraceae el género
más importante, desde el punto de vista económico, es Passiflora. Este género incluye
especies que presentan frutos comestibles, entre
los cuales se encuentran la parchita maracuyá y la parcha, así como otras especies de
uso medicinal u ornamental (Avilán, et al,
199).
La mayoría, si no todas, las plantaciones de
parchita y parcha en Venezuela se realizan mediante semillas cosechadas de
siembras anteriores, sin embargo, estas son especies que presentan polinización cruzada, realizada por insectos,
lo cual causa una considerable variabilidad genotípica y fenotípica dentro de
las plantaciones, presentándose plantas con diferencias en el crecimiento,
tipos de frutos, maduración y tolerancia a diferentes condiciones ambientales,
lo cual tiende a disminuir la productividad y hace más difícil las labores
culturales en las plantaciones. La propagación de estas especies a través de la técnica de cultivo in vitro, puede permitir obtener un gran
número de plantas idénticas a la planta madre, de ahí la importancia de poder
regenerar nuevas plantas a partir de plantas adultas, a las cuales se les
conozca su comportamiento agronómico.
Tomando
en consideración las ventajas de la propagación asexual y las técnicas de
cultivo de tejidos vegetales in vitro se realizaron estos ensayos, con el fin de
evaluar
la respuesta de dos tipos de explantes tomados de plantas adultas de las especies de
parchita maracuyá (Passiflora edulis f. flacicarpa)
D. y parcha (Passiflora quadrangularis) y
determinar la dosis de Benzil-amino-purina (BAP), que
permite mayor regeneración en ambos explantes.
MATERIALES
Y MÉTODOS
El
presente ensayo se llevó a cabo en las instalaciones del Laboratorio de Biotecnolología, ubicado en el Campus Juanico de la
Universidad de Oriente en Maturín, Núcleo Monagas. Se realizaron dos ensayos, para determinar la
regeneración de plantas en cultivo in
vitro en dos especies: Parchita maracuyá y parcha granadina o badea,
utilizando como explantes discos foliares y yemas
axilares. En ambos ensayos se utilizaron diferentes dosis de Benzil –amino-purina (0,0;
0,5; 1,0; 1,5 y 2,0 mg.l-1 de BAP) en un medio Murashige
y Skoog, con
la adición de 30 g/l de sacarosa y solidificado con 7 g.l-1 de agar, el pH fue ajustado a 5,8.
Para
el ensayo de regeneración mediante explantes foliares
se utilizaron discos foliares de 1 cm de diámetro aproximadamente, provenientes
de hojas jóvenes de plantas adultas y en producción, tratando de seleccionar
hojas que presentaran tamaño similar. La
desinfección de los discos foliares se realizó con lavado de las hojas
con abundante agua, posteriormente se sumergieron en una solución de alcohol al
70% por un minuto, luego en solución de agua y cloro comercial (5% de
hipoclorito de sodio) en relación 3:1 por 20 minutos. Posteriormente se
realizaron tres enjuagues con agua destilada estéril dentro de la cámara de
flujo laminar. Una vez extraídos los discos foliares con la ayuda de
sacabocados metálicos de 1cm de diámetro, tomados del
la zona central de las hojas y teniendo cuidado de que tuviesen sectores de las
nervaduras de las hojas, se colocaron 10
en cada cápsula de Petri con los diferentes tratamientos, bajo un diseño
estadístico de bloque al azar en arreglo factorial, con cinco repeticiones y
una unidad experimental representada por tres cápsulas de Petri en cada una de
las cuales se colocaron diez explantes con la cara abaxial de las hoja en contacto con el medio de cultivo.
Los explantes inoculados fueron colocados en completa oscuridad durante l5
días y luego colocados en régimen de 15
horas de luz y 9 horas de oscuridad, una temperatura de 27 +/-1C y una
intensidad de luz de 32 µEm2s-1
En el
ensayo de regeneración mediante yemas axilares se utilizaron aquellas que se
encuentran hasta 10 cm del ápice de las
ramas de plantas adultas y en producción. Los explantes
fueron sometidos a lavado y desinfección similar al utilizado con los discos
foliares. La inoculación se realizó en tubos de ensayos de 12 cm de largo y 2,5
cm de diámetro conteniendo cerca de 10 ml de medio, colocándose un explante por tubo. Se utilizó un diseño estadístico
completamente aleatorizado en arreglo factorial
con 5 repeticiones, cada unidad experimental estuvo representada por
cinco explantes por tratamiento. Se colocaron los explantes en la cámara de crecimiento en condiciones
ambientales similares a las utilizadas con los explantes
foliares, solo que no se colocaron en completa oscuridad.
En los
dos ensayos, los datos obtenidos fueron estudiados mediante el análisis de varianza y las
diferencias entre los tratamientos mediante la Prueba de Ámbitos Múltiples de
Duncan al 5%. Los parámetros evaluados
fueron: Porcentaje de supervivencia de explantes
al utilizar yemas axilares a los 25, 35
y 45 días después de la inoculación, porcentajes de explantes
con formación de brotes a los 25, 35
días después de la inoculación y el número medio de brotes por explantes, a los 45 días.
RESULTADOS
Regeneración de
explantes foliares
Al utilizar discos foliares
no hubo regeneración en P. edulis f. flavicarpa ni tampoco en P.
quadrangularis.
En la primera evaluación, realizada 15 días después de la siembra en los
explantes foliares no hubo formación de brotes pero
si de callos en todos los tratamientos, después de los 25 días de la siembra se
observó que los explantes comenzaron a necrosar igual
que los callos ya formados. A los 35 días después de la siembra todos los explantes estaban
necrosados.
Regeneración de yemas axilares
En la evaluación para el porcentaje se
sobrevivencia de los explantes realizada a los 15
días después de la inoculación el análisis de varianza indica que no hubo
diferencia estadísticamente significativa entre las especies, entre las dosis
utilizadas de BAP como tampoco para la interacción especies por dosis. En la
evaluación realizada a los 25 días después de la siembra el análisis de
varianza para este carácter mostró diferencias estadísticamente significativa
únicamente para el efecto simple entre las especies comportándose (Passiflora edulis f. flavicarpa) estadísticamente superior a Passiflora quandragularis (Cuadro
1).
|
Cuadro 1. Sobrevivencia de
los explantes de yemas laterales de parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa) y
parcha granadina (Passiflora quandragularis) bajo diferentes dosis de BAP
evaluados a los 25 días después de la inoculación. |
||
Especie de Passiflora
|
Sobrevivencia de los explantes (%) * |
|
|
P. edulis f. flavicarpa |
78,67 |
a |
|
P. quandragularis |
66,67 |
b |
|
* Prueba de Ámbitos Múltiples
de Duncan al 5%. Letras iguales indican similitud estadística entre los
tratamientos |
||
Para la evaluación realizada 35 días después de la inoculación el análisis de varianza
señaló diferencias estadísticamente significativa entre las especies y entre la
interacción de las especies con la dosis de BAP. La respectiva prueba de
promedios mostró que hubo alta regeneración en la parchita independientemente
de la dosis de BAP utilizada, mientras que en la parcha, la presencia de BAP en
el medio de cultivo aumentó la sobrevivencia de los explantes.
Al comparar la especie parchita con la parcha se pudo observar que en el
tratamiento testigo, en la parchita se obtuvieron un mayor porcentaje de
sobrevivencia en relación con la parcha. En el resto de los tratamientos ambas
especies se comportaron iguales (Cuadro 2).
|
Cuadro 2. Sobrevivencia de los explantes de yemas laterales de parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa) y parcha granadina (Passiflora quandragularis)
bajo diferentes dosis de bencilaminopurina
(BAP) evaluados a los 35 días después de la inoculación. |
|||
|
Especie de Passiflora |
Dosis de BAP (mg.l-1) |
Sobrevivencia de los explantes (%) * |
|
|
P. edulis f. flavicarpa |
0,0 |
80,00 |
a |
|
0,5 |
66,67 |
a |
|
|
1,0 |
80,00 |
a |
|
|
1,5 |
66,67 |
a |
|
|
2,0 |
80,00 |
a |
|
|
P. quadrangularis |
0,0 |
26,67 |
b |
|
0,5 |
66,67 |
a |
|
|
1,0 |
66,67 |
a |
|
|
1,5 |
66,67 |
a |
|
|
2,0 |
76,33 |
a |
|
|
* Prueba de Ámbitos Múltiples de Duncan al
5%. Letras iguales indican similitud estadística entre los tratamientos |
|||
En
la evaluación realizada a los 45 días después de la inoculación, el análisis
estadístico mostró diferencia solamente para el efecto simple entre las dosis
de BAP. La prueba de promedios respectiva muestra que en ambas especie
los tratamientos donde se utilizó BAP se comportaron estadísticamente iguales
entre sí, superando la sobrevivencia mostrada en los tratamientos donde no se
utilizó el regulador de crecimiento (Cuadro 3).
Al
comparar el porcentaje de sobrevivencia en diferentes épocas de evaluación, en
la primera fecha (15 días) tanto las dosis de BAP y las especies se comportaron
iguales. A los 25 días después de la inoculación, se muestra que la Parchita
presentó un mayor porcentaje de sobrevivencia en comparación con la Parcha,
manteniendo cierta estabilidad hasta la tercera evaluación (35 días) a partir
de la cual se observa que en ausencia del regulador de crecimiento la parcha
mostró los menores porcentajes de sobrevivencia. En la última evaluación (45
días) independientemente de la especie se observó que BAP induce una mayor
sobrevivencia de los explantes aunque no se
presentaron diferencias estadísticas entre los tratamientos que presentaron el
regulador de crecimiento.
|
Cuadro 3. Porcentaje de sobrevivencia de
los explantes de yemas laterales de parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa) y parcha granadina (Passiflora quandragularis)
bajo diferentes dosis de bencilaminopurina (BAP)
evaluados a los 45 días después de la inoculación. |
||
|
Dosis de BAP mg.l-1 |
Sobrevivencia de los Explantes (%)* |
|
|
2,0 |
76,67 |
a |
|
1,5 |
66,67 |
a |
|
0,5 |
63,34 |
a |
|
1,0 |
56,63 |
a |
|
0,0 |
33,33 |
b |
|
* Prueba de Ámbitos Múltiples de Duncan al
5%. Letras iguales indican similitud estadística entre los tratamientos |
||
Porcentaje
de explantes con brotes
El
análisis de varianza para el porcentaje de explantes
con nuevos brotes 25 días después de la inoculación determinó diferencia
significativa para el efecto de interacción entre las especies y la dosis de
BAP. La prueba de promedio respectiva mostró que todos los tratamientos se
comportaron estadísticamente similares entre sí, con la excepción del
tratamiento donde se utilizó la especie P. edulis
y se inocularon los explantes en medio que contenía
1,5 mg.l-1 de
BAP. En la evaluación realizada a los 35
días para este mismo carácter el análisis de varianza indicó que hubo
diferencia significativa para el efecto simple entre las especies y para el efecto de la interacción entre las especies y las dosis
de BAP. La prueba de promedios respectiva muestra que los tratamientos donde se
utilizaron las dosis de 0,5 y 1,0 mg.l-1 de BAP
en P. edulis y todos los tratamientos donde se
utilizó BAP en P. quadrangularis se
comportaron similares entre sí y presentaron mayor porcentaje de explantes con brotes (Cuadro 4).
|
Cuadro 4. Explantes de yemas axilaress de
parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa) y parcha granadina (Passiflora quandragularis) con formación de brotes bajo diferentes dosis
de bencilaminopurina
(BAP) evaluados a los 25 y 35 días después de la inoculación (DDI). |
|||||
|
Especie de Passiflora |
Dosis de BAP |
Explantes
con brotes (%) (DDI) |
|||
|
|
(mg.l-1) |
25 |
35 |
||
|
P. edulis f. flavicarpa |
0,0 |
40,00 |
ab |
40,00 |
b |
|
0,5 |
76,70 |
a |
83,33 |
ab |
|
|
1,0 |
60,00 |
ab |
76,67 |
ab |
|
|
1,5 |
26,70 |
b |
46,67 |
b |
|
|
2,0 |
53,30 |
ab |
46,67 |
b |
|
|
P. quadrangularis |
0,0 |
70,00 |
ab |
50,00 |
b |
|
0,5 |
53,30 |
ab |
73,33 |
ab |
|
|
1,0 |
53,30 |
ab |
83,33 |
ab |
|
|
1,5 |
80,00 |
a |
100,00 |
a |
|
|
2,0 |
80,00 |
a |
100,00 |
a |
|
|
* Prueba de Ámbitos Múltiples de Duncan al 5%. Letras iguales indican
similitud estadística entre los tratamientos |
|||||
Números de
brotes por explantes
El
análisis de varianza para el número de brotes por explantes
de yemas laterales en la evaluación realizada
45 después de la inoculación mostró diferencia significativa para el
efecto simple entre las especies, entre las dosis y para la interacción entre
ambos factores. La prueba de promedios indica que los tratamientos donde se
utilizó las dosis de 1,5 y 2,0 mg.l-1 de BAP en parcha obtuvieron el mayor número de brotes
por explantes. Sin embargo es importante señalar que los
brotes obtenidos al utilizar estas dosis son pequeños, debido a la competencia
entre ellos, lo cual en algunos casos dificulta su separación posterior y su
crecimiento (cuadro 5).
|
Cuadro 5. Número de brotes por explantes de
yemas laterales de parchita (Passiflora edulis f. flavicarpa) y parcha granadina (Passiflora quandragularis) bajo diferentes dosis de bencilaminopurina
(BAP) evaluados a los 45 días después
de la inoculación. |
|||
|
Especie de Passiflora |
Dosis de BAP (mg.l-1) |
Brotes/explante |
|
|
P. edulis f. flavicarpa |
0,0 |
1,03 |
cd |
|
0,5 |
3,00 |
b |
|
|
1,0 |
2,62 |
bc |
|
|
1,5 |
1,60 |
bcd |
|
|
2,0 |
1,83 |
bcd |
|
|
P. quadrangularis |
0,0 |
0,50 |
d |
|
0,5 |
2,93 |
b |
|
|
1,0 |
3,10 |
b |
|
|
1,5 |
6,10 |
a |
|
|
2,0 |
7,37 |
a |
|
|
* Prueba de Ámbitos Múltiples de Duncan al
5%. Letras iguales indican similitud estadística entre los tratamientos |
|||
DISCUSIÓN
La regeneración in vitro en parchita (Passiflora edulis. f. flavicarpa.) se ha obtenido de ápices y segmentos nodales (Faria
y Segura, 1997a; Monteiro et al., 2000; Reis et
al., 2003) o de los brotes adventicios desarrollados de discos de la hoja (Dornelas y Vieira, 1994; Appezzato-da-Glória et al., 1999), hipocótilos
(Faria y Segura, 1997b), o segmentos internodales (Biasi et al.,
2000). Los protocolos optimizados han sido establecidos principalmente usando
diversas combinaciones de los reguladores de crecimiento, tales como BAP e IBA
(Kawata y et al., 1995), BAP y NAA (Dornelas y Vieira, 1994), BAP e IAA (Faria
y Segura, 1997b), y diversas soluciones de sales (Faria
y Segura, 1997b; Monteiro et al., 2000).
En este ensayo no se logró
la regeneración de discos foliares provenientes de hojas de plantas adultas. En
este sentido, Drew. (1991) indica la dificultad de regeneración de Passifloras a partir de tejidos adultos, logrando un
porcentaje relativamente bajo de producción de nuevas plantas a partir de explantes
nodales y la suplementación del medio MS con diferentes combinaciones de Kinetina y Acido Indol Acético
(AIA). Sin embargo, es importante señalar que a partir de plantas jóvenes de
Parchita se puede obtener regeneración, así los demuestra Otahola
(1999), utilizando explantes foliares provenientes de
plantas jóvenes de Passiflora
edulis f. flacicarpa D., quien reporta que la hormona BAP en todas las dosis utilizadas (0;
0,3; 0,6; 0,9 y 1,2 mg.l-1), induce la formación de callos y
brotes, sobresaliendo la dosis de 0.6 mg.l-1 en la formación de brotes en los explantes.
Boffino, et al.
(2000) desarrollaron la metodología para la regeneración de plantas de P. suberosa a partir de discos foliares,
indicando mayor regeneración de los explantes al
utilizar dosis de 0,5 y 1,0 mg.l-1 de BAP, formándose inicialmente callos y posteriormente
yemas. Estos resultados difieren a los obtenidos en este experimento, donde no
fue posible la regeneración de tejidos a partir de discos foliares.
Kawata et
al (1995) reporta alta regeneración
de plantas jóvenes de Parchitas al utilizar explantes
foliares en medio MS suplementado con 3% de sacarosa, 1 mg.l-1 de BAP
y 1 mg.l-1 de IBA,
indicando así mismo que al ser transferidos los explantes
a un medio sin hormonas se produce un rápido enraizamiento. Sin embargo, no se
reportan resultados de regeneración de discos foliares provenientes de plantas
adultas.
Dornellas y Carneiro (1994) al trabajar con diferentes tipos de
explantes en varias especies de pasifloras, reportan
la presencia de organogénesis directa en P. edulis , sin pasar por estado
de callos. Similares resultados se obtuvieron en este ensayo, donde no se
obtuvo formación de callos en P. edulis,
mientras que en P. quadrangularis la
regeneración fue indirecta.
Scorza y Janick (l978), estudiando la regeneración
de plantas de varias especies de Passifloraceae,
verificaron inicialmente que la citocinina 6-BAP
(6-Bencialamonopurina) en combinación con el ácido naftaleniacetico
(ANA) estimula, en discos foliares y segmentos nodales, la formación de partes
aéreas, aunque solo cuando se utilizan plántulas provenientes de semillas.
Moran
Robles (1979) indica que existe gran
potencial morfogénetico en segmentos caulinares no meristemáticos de P. edulis y Passiflora mollissima. Después de probar diversas composiciones
básicas del medio de cultivo combinados con fitoreguladores, concluyó que la presencia de cinétina es importante para la diferenciación de yemas y
partes aéreas de las dos especies y que el enraizamiento es estimulado por la
presencia de IAI (Ácido indolacetico). Sin duda el
potencial de regeneración se observó en P.
edulis y en P. quqdrangularis, especialmente al
utilizar yemas axilares. Sin embargo, es evidente que la mayoría de los
experimentos y resultados se han obtenido al utilizar plantas jóvenes y no
plantas adultas.
CONCLUSIONES
No se obtuvo regeneración al utilizar como explante los discos foliares, pero si al utilizar yemas axilares. El BAP indujo la formación de brotes en todas las dosis utilizadas, P. quadrangularis presentó un mayor número de brotes/explante al utilizar las dosis de 1,5 y 2,0 mg.l-1 con un promedio de 6 y 7 brotes por explante respectivamente, mientras que en P. edulis se obtuvieron 3 brotes/explante con la dosis de 0,5 mg.l-1 de BAP. Se presentaron callos solamente en P quadrangularis, mientras que en P. edulis se presentó organogénesis
directa.
AGRADECIMIENTO
Los autores expresan su agradecimiento al
Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente por el financiamiento del
presente trabajo a través del Proyecto de Investigación bajo la responsabilidad
del segundo autor
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diseñada por Prof. Jesús Rafael Méndez Natera
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AGRÍCOLA
